NMDA受体-1亚单位磷酸化在新生SD大鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用机制

论文摘要

脑神经细胞N—甲基—D—天冬氨酸（N-Methyl-D-Aspartate，NMDA）型谷氨酸受体的激活在缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic Ischemic Brain Damage，HIBD）的病理生理过程中占据着十分重要的地位。本研究的目的是了解NMDA受体-1亚单位（NR1）磷酸化在新生Sprague-Dawley（SD）大鼠HIBD中的作用机制。方法：7日龄SD大鼠随机分为正常对照组、缺氧缺血（HIBD）组（HIBD动物模型制作采用右颈总动脉结扎并低氧吸入的方法）和NMDA微量注射组。应用TTC染色了解脑组织损伤大体情况；应用免疫荧光组化染色和Western Blot共同了解NRl、phospho-NR1 S897表达；应用流式细胞仪技术测定各组脑细胞线粒体膜电势（△Ψm）变化规律，了解其线粒体受损程度；应用荧光光谱仪进行细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)测定。应用SPSS11．1统计软件进行数据的统计学分析，P＜0.05时被认为具有统计学意义。结果：（1）正常对照组：TTC染色呈红色，免疫组化染色和Western Blot检测均显示脑皮质神经细胞NR1表达呈阴性、而phospho-NR1 S897呈高表达，右侧大脑半球△Ψm为（18.21±1.26）MFL，[Ca2+]i为（559.24±52.36）nmol／L，左右大脑半球△Ψm及[Ca2+]j基本相等。（2）HIBD组：TTC染色显示HI损伤后12h可观察到白色或粉红色受损脑组织，HI后24h和48h时损伤最严重、其损伤容积与全脑容积比分别为（0.172±0.012）和（0.183±0.017），与正常相比较差异有统计学意义，之后脑组织损伤开始恢复；HI损伤使NR1阳性表达细胞增加，phospho-NR1 S897阳性表达细胞减少，二者发生的部位之间有明显的相对应关系。phospho-NR1 S897的表达在HI损伤后3h-24h之间呈进行性下调，HI损伤后3、6、12和24h的phospho-NR1S897阳性细胞数为（64±19）、（48±16）、（38±15）和（21±8），其中12h、24h阳性细胞数与正常相比较差异有统计学意义（p＜0.05）；phospho-NR1 S897的Western Blot表达呈进行性减弱，HIBD后6h、12h和24h的发光条带密度值与正常相比分别降低22.2％、65.7％和94.1％，其中HIBD后12h和24h的结果与正常相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；HI损伤侧△Ψm则呈现“降低-恢复-再降低-再恢复-再降低”的改变，右侧：左侧△Ψm比值在HI后0、4、24h出现3次降低，分别为（0.80±0.17）、（0.70±0.22）、（0.71±0.13），变化最明显的部位是大脑皮质区；HI损伤侧大脑半球的[Ca2+]i为（789.64±55.78）nmol／L，明显高于正常新生鼠且差异具有统计学意义（P＜0.05）。（3）NMDA微量注射组：注射后0-4h内TTC染色均大致正常；免疫组化染色、[Ca2+]i的改变和Western Blot表达与HIBD组类似。免疫组化染色结果显示NR1阳性表达细胞数逐渐增多，注射后1hphospho-NR1 S897表达明显下调，几乎未见阳性染色细胞；△Ψm值呈进行性降低，注射后15min、30min、1h和2h注射侧：注射对侧△Ψm比值分别为（0.84±0.65）、（0.66±0.16）、（0.66±0.21）和（0.61±0.36），与正常对照相比差异均具有统计学意义（P＜0.05）；NMDA微量注射后左右大脑半球[Ca2+]i的改变与HIBD类似，注射侧[Ca2+]i值为（667.52±47.78）nmol／L，明显高于正常对照组且差异具有统计学意义（P＜0.05）；丘脑区和海马回NR1的Western Blot表达明显增强、Phospho-NR1 S897表达明显减弱。结论：（1）NR1 S897位点的磷酸化使7日龄新生大鼠脑皮质神经细胞具有正常生理功能；HI损伤使NR1 S897位点的磷酸化表达进行性下调，细胞不能发挥正常功能；（2）NMDA注射可诱导与HI损伤类似的变化，进一步证实了缺氧缺血性脑损伤中“HI—NMDA—phospho-NR1 S897去磷酸化—细胞损伤”损伤途径的重要性；（3）加强对影响phospho-NR1 S897磷酸化过程的调控因子研究可对开发减轻HI脑损伤的新途径提供实验依据。

论文目录

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• 表格目录
• 缩略词
• 第一章 概述
• 1.1 缺氧缺血性脑病
• 1.1.1 缺氧缺血性脑病的临床概述
• 1.1.2 HIE的病理生理基础
• 1.1.3 HIE的动物模型
• 1.1.4 缺氧缺血性脑损伤保护剂的类型
• 1.2 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体
• 1.2.1 NMDA受体是中枢神经系统中的重要兴奋性氨基酸受体
• 1.2.2 组成NMDA受体的亚单位
• 1.2.3 NMDA受体的特性
• 1.3 NMDA受体激活与HIE
• 1.3.1 HI损伤激活NMDA受体
• 1.3.2 NMDA受体激活导致脑细胞凋亡/和坏死
• 1.3.3 NMDA受体激活影响细胞线粒体功能
• 1.3.4 NMDA受体激活与细胞内钙超载
• 1.4 NMDA受体功能的调节
• 1.5 研究目的
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验试剂及仪器
• 2.1.1 实验试剂
• 2.1.2 自备溶液配方
• 2.1.3 仪器
• 2.2 实验设想
• 2.3 实验动物及分组
• 2.4 标本制备
• 2.4.1 HIE模型制作
• 2.4.2 NMDA脑皮质内微量注射
• 2.4.3 脑冠状切片标本制备
• 2.4.3.1 TTC染色用冠状脑片制备
• 2.4.3.2 荧光免疫组化染色用脑冠状切片制备
• 2.4.4 脑细胞悬液制备
• 2.4.5 脑细胞蛋白质提取
• 2.5 TTC染色
• 2.5.1 TTC染色步骤
• 2.5.2 脑损伤程度计算方法
• 2.6 免疫荧光染色
• m）'>2.7 流式细胞仪检测脑细胞线粒体膜电势（Δψ_m）
• 2.8 Western Blotting
• 2+]_i)测定'>2.9 细胞内游离钙([Ca²⁺]_i)测定
• 2.10 统计学分析
• 第三章 结果
• 3.1 正常7日龄SD大鼠脑皮质NR1及phospho-NR1 S897表达
• 3.2 HI后脑皮质NR1及phospho-NR1S897表达
• 3.2.1 NR1表达与phospho-NR1 S897表达的部位成对应关系
• 3.2.2 HI后大脑皮质phospho-NR1 S897免疫荧光表达
• 3.2.3 HI后大脑皮质phospho-NR1 S897阳性细胞计数
• 3.3 NMDA微量注射后脑皮质NR1及phospho-NR1S897表达
• 3.3.1 10nmol NMDA微量注射后不同时间点NR1表达
• 3.3.2 不同浓度NMDA微量注射2h后NR1表达
• 3.3.3 10nmol NMDA微量注射后1h phospho-NR1 S897表达
• 3.4 TTC染色
• 3.4.1 HI后脑损伤程度
• 3.4.2 不同浓度NMDA微量注射后2h脑组织TTC染色
• 3.4.3 10nmolNMDA微量注射后1h脑组织TTC染色
• m水平'>3.5 各组Δψ_m水平
• m的变化规律'>3.5.1 HI损伤后Δψ_m的变化规律
• m的变化规律'>3.5.1.1 HI损伤后全大脑半球Δψ_m的变化规律
• m比值的变化'>3.5.1.2 海马、大脑皮质、丘脑右侧:左侧Δψ_m比值的变化
• m的变化规律'>3.5.2 10nmolNMDA微量注射后Δψ_m的变化规律
• 2+]_i测定结果'>3.6 [Ca²⁺]_i测定结果
• 3.7 Western Blot结果
• 3.7.1 HIBD后脑皮质Phospho-NR1 S897 western blotting结果
• 3.7.2 HIBD后24h及不同浓度MDA脑皮质内注射后Western blot结果
• 第四章 讨论
• 4.1 HI损伤后NR1表达上调而phospho-NR1 S897表达下调
• 4.2 关于NMDA脑皮质内微量注射
• 4.3 NMDA诱导与HI损伤后类似的NR1和Phospho-NR1 S897表达
• 4.3.1 NMDA诱导NR1表达上调
• 4.3.2 NMDA诱导脑皮质phospho-NR1 S897表达下调
• 4.4 HI及NMDA微量注射导致线粒体膜电势的相似改变
• 4.4.1 线粒体膜电势是研究兴奋性氨基酸毒性的敏感指标
• m的原发性及继发性降低'>4.4.2 HI后Δψ_m的原发性及继发性降低
• m结果之间的差异'>4.5 TTC染色结果与IHC、Δψ_m结果之间的差异
• 2+]_i结果进一步证实NMDA毒性与HI损伤的相关性'>4.6 [Ca²⁺]_i结果进一步证实NMDA毒性与HI损伤的相关性
• 第五章 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 在读期间的主要研究成绩