酶法制备高含量二亚油酰磷脂酰胆碱的研究

论文摘要

磷脂酰胆碱（PC）是人体细胞膜的基本构成成分,对于维持生物膜的生理活性和机体的正常代谢起关键作用。二亚油酰磷脂酰胆碱（DLPC）作为其中的主要活性成分,在生物化学和细胞生理学方面都具有十分重要的意义。它具有促进肝细胞的再生、减轻肝细胞脂肪变性和坏死、改善血液和肝脏的脂质代谢以及防治肝硬化和肝纤维化等功能,从而保护肝细胞免受损害。为了提高大豆PC中DLPC含量,本研究以固定化脂肪酶Lipozyme TL IM为工具酶,于正庚烷体系中催化大豆PC与亚油酸（LA）酸解反应。首先,实验对脂肪酶及其反应介质作出筛选,最终确定正庚烷体系下脂肪酶Lipozyme TL IM催化酸解反应。然后以产品LA含量作为考察指标,探讨PC浓度（PC/正庚烷,g/mL）、底物比（LA/PC,g/g）、酶添加量（以底物总质量为基准,%）、水分添加量（以溶剂体积为基准,μL/mL）、反应时间（h）、反应温度（℃）对酸解反应的影响,并结合Plackett-Burman设计法对这六个因素进行研究,筛选出底物比、反应温度和酶添加量为主要的影响因子。在此基础之上,通过响应曲面法对底物比、反应温度和酶添加量的最佳水平及其交互作用作进一步考察以优化反应条件。通过逐步回归分析建立二次多项式模型,利用方差分析对该模型进行了显著性检验,最终获得的最佳反应条件为:PC浓度,0.25g/mL;底物比,2.81;酶添加量,23.92%;反应温度,61.57℃;反应时间,48h;水分添加量,3μL/mL,该条件下得到的产品经GC检测得其LA含量高达83.24%,固定化脂肪酶Lipozyme TL IM表现出了较好的稳定性。产品各项理化指标均符合SB/T 10206-1994磷脂通用技术条件的要求,经HPLC/TLC/HPLC-MS分离、鉴定与检测,于UV-205nm归一化得PC中DLPC含量为69.07%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 二亚油酰磷脂酰胆碱的概述
• 1.2 二亚油酰磷脂酰胆碱的生理功能
• 1.3 磷脂酰胆碱改性
• 1.3.1 物理改性
• 1.3.2 化学改性
• 1.3.3 酶法改性
• 1.4 磷脂酰胆碱酶法改性研究现状
• 1.5 目的和意义
• 1.6 主要研究内容
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PC90 与亚油酸的酸解反应
• 2.2.2 游离脂肪酸的薄层色谱检测
• 2.2.3 产品中亚油酸的定量分析
• 2.2.4 理化指标的测定
• 2.2.5 二亚油酰磷脂酰胆碱分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 游离脂肪酸的检测
• 3.2 脂肪酶与反应体系的选择
• 3.2.1 脂肪酶的筛选
• 3.2.2 反应介质的选择
• 3.2.3 酶活与反应介质理化特性的关系
• 3.3 单因素实验
• 3.3.1 底物比对亚油酸含量的影响
• 3.3.2 PC 浓度对亚油酸含量的影响
• 3.3.3 水分添加量对亚油酸含量的影响
• 3.3.4 酶添加量对亚油酸含量的影响
• 3.3.5 反应时间对亚油酸含量的影响
• 3.3.6 反应温度对亚油酸含量的影响
• 3.4 Plackett-Burman 实验设计
• 3.4.1 Plackett-Burman 实验设计
• 3.4.2 酸解反应中关键影响因子的确定
• 3.5 响应面优化实验设计
• 3.5.1 模型建立及回归分析
• 3.5.2 响应曲面分析
• 3.5.3 酸解工艺条件的确定
• 3.6 酶的稳定性实验
• 3.7 产品指标与脂肪酸分析
• 3.7.1 理化指标分析
• 3.7.2 脂肪酸分析
• 3.8 PC 分子种类的分离鉴定
• 3.8.1 产品PC 的分离制备
• 3.8.2 PC 的TLC 鉴定
• 3.8.3 二亚油酰磷脂酰胆碱的分离和鉴定
• 结论
• 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录作者在攻读硕士学位期间发表的论文