甘草质膜水通道蛋白GuPIP1的分子克隆、定位和表达调控

论文摘要

水分是影响植物生长发育和限制农作物产量提高的主要环境因子。按复合水分运输模型,水分在植物体内运输有三个途径,即质外体途径、共质体途径和跨细胞途径。水通道蛋白为水分跨细胞膜的运输提供了一条选择性通道。植物水通道蛋白是一个超家族,根据氨基酸序列同源性和亚细胞定位可以划分为四个家族:质膜内在蛋白PIP、液泡膜内在蛋白TIP、类Nodulin26膜内在蛋白NIP和小的基本膜内在蛋白SIP。PIP被分为两个亚家族:PIP1和PIP2。从序列水平看,与PIP2亚家族成员相比,PIP1亚家族成员有一个长的N末端和短的C末端。PIP1和PIP2亚家族成员在功能上也存在差异。在爪蟾卵母细胞中异源表达时,与PIP2蛋白相比,PIP1表现没有或具较低的水通道活性。植物水通道蛋白的活性可能受门控机制调控。影响门控行为的因子可能包括磷酸化、异源基因化、pH、Ca2+、渗透压、溶质梯度和温度。植物水通道蛋白在植物种子萌发、细胞伸长、气孔运动、受精等过程中调节水分的快速跨膜运输。有些水通道蛋白还在植物逆境应答中起重要作用,因此研究水通道蛋白与植物抗逆性的关系引起了广泛关注。植物主要通过调控细胞质膜水通道蛋白的表达来消除水分供应中的波动。本研究的主要目的是以荒漠植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）为研究对象来分离、鉴定质膜水通道蛋白基因,研究其定位和表达模式,以探讨它们在植物抗逆应答中的作用。1.根据植物质膜水通道蛋白NPA保守区设计简并引物,利用RT-PCR和RACE技术,从甘草根中克隆到一个水通道蛋白基因,命名为GuPIP1。序列分析表明,基因全长cDNA序列为1.236kb,包含长度为71bp的5′非编码区、870bp的开放阅读框及295bp的3′非编码区。该基因编码一个由290个氨基酸残基组成的蛋白质（基因已登录GenBank,登录号为AY781788）。2 .生物信息学分析表明,甘草GuPIP1不但具有MIP家族的信号序列（SGXHXNPAVT）,而且具有质膜水通道蛋白的特征信号序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSI/FGAAI/VI/VF/YN。同时甘草GuPIP1具有水通道蛋白典型的6个跨膜区和两个NPA单元,在第1和第4跨膜区均具有与水通道形成有关的高度保守的EXXXTXXF/L单元,与已经证明具有水通道蛋白功能的AtPIP1;4和ZmPIP1;5功能区的氨基酸序列高度一致,与其同源性高的其它植物水通道蛋白均为PIP1亚家族的成员,而其本身的N-末端比C-末端长46个氨基酸,符合植物水通道蛋白PIP1亚家族成员的N-末端长的特点,因此,甘草GuPIP1应属于PIP1亚家族成员。3.Western blot分析表明,甘草GuPIP1基因在幼苗的根、茎、叶中均有表达,不具有明显的组织特异性。甘草GuPIP1可能在整株植物的水分运输中发挥作用。

论文目录

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第一部分引言

一、水通道蛋白的发现及命名

二、水通道蛋白的分子结构

（一）水通道蛋白的初级结构

（二）水通道蛋白的高级结构

三、植物水通道蛋白的多样性及分类

四、植物水通道蛋白的功能

（一）植物水通道蛋白的选择性

（二）植物水通道蛋白的选择性的分子基础

（三）植物水通道蛋白的生理功能

五、植物水通道蛋白的活性调控

（一）植物水通道蛋白的转录后水平的调控

（二）植物水通道蛋白的膜运输调控

（三）植物水通道蛋白的转录水平的调控

六、植物水通道蛋白的研究方法和手段

（一）植物水通道蛋白的功能检测

（二）植物水通道蛋白的定位和表达分析

七、甘草抗旱性研究现状

八、本研究的目的与意义

第二部分实验材料与方法

一、实验材料

（一）实验植物和动物

（二）分子生物学和生化试剂

（三）主要实验仪器

二、实验方法

（一）植物材料的处理

（二）植物组织基因组DNA 的抽提

（三）植物组织总 RNA 的抽提

（四）甲醛变性凝胶电泳检查总 RNA 的完整性

（五）总 RNA 的浓度测定

（六）用QIAGEN Oligotex mRNA 纯化试剂盒从植物总RNA 中纯化mRNA

（七）用Invitrogen 的cDNA 合成试剂盒合成cDNA 第一链

（八） RACE cDNA 的合成

（九） RT-PCR 扩增反应

（十）用QIAGEN凝胶回收纯化试剂盒回收纯化cDNA扩增产物

（十一） cDNA 与pCR?-XL-TOPOVector 连接

（十二）转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α

（十三）大肠杆菌感受态细胞的制备

（十四）碱提法小量制备质粒 DNA

（十五）用 QIAGEN 质粒精提试剂盒制备质粒

（十六）质粒 DNA 的酶解

（十七） DNA 序列测定

（十八） DNA 序列分析

（十九）水通道蛋白多克隆抗体的制备

（二十）甘草根质膜囊泡的制备及质膜蛋白的增溶

（二十一） Western blot

（二十二）蛋白免疫组织细胞化学定位

（二十三） Realtime PCR

第三部分实验结果与分析

一、甘草质膜水通道蛋白 GuPIP1 基因的分子克隆

二、甘草质膜水通道蛋白 GuPIP1 的免疫化学组织定位

三、甘草质膜水通道蛋白 GuPIP1 的差异表达

第四部分讨论

一、甘草 GuPIP1 属于植物水通道蛋白 PIP1 亚家族成员

二、甘草 GuPIP1 可能参与了甘草根系的水分跨膜运输

三、甘草 GuPIP1 可能参与了甘草植株水分平衡的调节

四、甘草 GuPIP1 活性调节的可能机制

五、甘草 GuPIP1 可能是一种多功能水通道蛋白

结论

主要创新点

参考文献

主要英文缩写词表

致谢

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