四川食用菌病毒dsRNA的检测和对多菌灵的敏感性测定

论文摘要

食用菌病毒是真菌病毒的一部分,绝大部分食用菌病毒的基因组是由dsRNA组成,而且多数是多节段的。食用菌病毒具有很强的潜隐性,除双孢蘑菇病毒病是典型的爆发性病害外,其它食用菌病毒通常并不引起寄主明显病征,这为食用菌病毒病害的早期诊断带来麻烦,对生产造成病害隐患。dsRNA技术是在研究真菌病毒的过程中发展起来的检测RNA病毒的技术,具有准确、方便和快捷的优点,是目前检测食用菌病毒最为常用的方法。多菌灵（Carbendazim）为苯并咪唑类广谱内吸性杀菌剂,对许多真菌（包括子囊菌、半知菌和担子菌）有抑制和杀灭作用,食用菌生产上常用来抑制杂菌生长,提高菌袋成功率。但是,多菌灵化学性质相当稳定,残效期较长,其对食品安全性的影响引起了越来越多人的关注。为了了解四川省食用菌中dsRNA病毒的携带情况,为病毒病害的防治与食用菌脱毒育种提供一定依据,同时了解四川省主要栽培的食用菌菌株对多菌灵的敏感性及多菌灵在子实体中的残留,为多菌灵的正确和科学使用提供参考,我们于2006～2008年从四川省内主要的食用菌科研单位和食用菌产区,通过征集试管母种和采集子实体组织分离的方法获得包括双孢蘑菇、香菇、平菇、茶树菇、鸡腿菇和金针菇等主要大面积栽培的食用菌菌株87个,对它们进行了dsRNA检测及阳性菌株的高温、低温和药物处理,多菌灵敏感性测定,同时选取茶树菇进行了多菌灵在子实体中的残留测定,从而明确了四川食用菌病毒dsRNA的携带情况和对多菌灵的敏感性及多菌灵在子实体中的残留,其结果如下:1.对所采集的87个食用菌菌株进行dsRNA的提取,经1%琼脂糖凝胶电泳分析表明:所检测的87个食用菌菌株中,有26个菌株含有dsRNA,占29.9%。其中:平菇类中有16个,占平菇类的38.1%;香菇类有9个,占香菇类的81.8%:其它珍稀菌类1个,占11.1%;不同地理来源和品种的双胞蘑菇、金针菇、鸡腿菇和木耳菌株均未检测到dsRNA。2.平菇、凤尾菇、秀珍菇、香菇和茶树菇dsRNA阳性菌株经过高温、低温和药物脱毒处理后,采用dsRNA分析技术进行检测,所有菌株电泳图谱dsRNA条带均依然存在,表明脱毒难度大。经过高温、低温和药物处理前后在PDA平板上的生长速度的差异显著性因处理方法和菌株不同而不同。其中平菇菌株经高温处理前后平均生长速度有明显差异;凤尾菇菌株经cycloheximide处理前后生长速度有明显差异。其它菌株各处理前后无明显变化。3.对平菇、香菇、双孢蘑菇、茶树菇、金针菇、鸡腿菇、木耳及其它珍稀菌类共60个食用菌菌株进行的多菌灵敏感性测定表明不同品种和类别及相同品种不同菌株对多菌灵具有不同的敏感性,其EC50差异很大。在无药平板上,各菌类菌丝能够正常生长形成菌落,菌丝洁白健壮。在含药平板上,平菇、双孢蘑菇、茶树菇、鸡腿菇和木耳菌丝生长均受到抑制,随着药剂浓度的增加,菌落直径也逐渐减小。平菇和茶树菇菌株对多菌灵有一定耐受力,EC50分布12.9～37μg/ml之间;双胞蘑菇和鸡腿菇对多菌灵的耐受力次于平菇,EC50分布3.4～4.07μg/ml之间;木耳菌株对多菌灵最敏感,EC50分布0.12～0.23μg/ml之间。,而香菇和金针菇菌株对多菌灵极不敏感,在0～200μg/ml的6个浓度梯度下菌落直径无显著差异4.通过对茶树菇子实体残留多菌灵进行液相色谱分析,在袋料培养基中按干料重的0.05%、0.1%和0.2%添加多菌灵的三种处理菌袋长出的茶树菇子实体中都有特征峰出现,表明都有多菌灵残留,测定其含量分别为0.01μg·g-1、0.04μg·g-1和0.09μg·g-1,残留量随添加比例增加而增高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 食用菌的经济价值
• 2 食用菌病毒病的研究概述
• 2.1 食用菌病毒的形态
• 2.2 食用菌病毒的基因组与外壳蛋白特征
• 2.3 食用菌病毒病的症状和病理变化
• 2.4 食用菌病毒的起源与复制
• 2.5 食用菌病毒的传播
• 2.6 食用菌病毒的检测
• 3 多菌灵在食用菌中的应用状况
• 材料与方法
• 1 DSRNA的提取与电泳分析
• 1.1 供试菌株
• 1.2 菌丝体培养
• 1.3 dsRNA的提取与电泳
• 1.4 酶解试验
• 2 病毒脱除试验
• 2.1 高温培养法
• 2.2 低温冷冻法
• 2.3 药物法
• 3 食用菌菌株对多菌灵敏感性测定
• 3.1 供试菌株
• 3.2 供试药剂
• 3.3 含药培养基的制备
• 3.4 测定方法
• 4 食用菌生产中主要污染霉菌对多菌灵敏感性测定
• 4.1 菌落直径法
• 4.2 孢子萌发法
• 5 多菌灵在食用菌子实体中的残留
• 5.1 供试材料
• 5.2 子实体生产
• 5.3 多菌灵残留分析
• 结果与分析
• 1 四川食用菌中病毒DSRNA检测结果
• 2 不同脱毒处理对DSRNA阳性菌株的影响
• 3 食用菌菌株对多菌灵的敏感性
• 4 主要污染霉菌对多菌灵的敏感性
• 4.1 霉菌菌丝对多菌灵的敏感性
• 4.2 多菌灵对霉菌孢子萌发的影响
• 5 多菌灵在子实体中的残留
• 5.1 菌丝生长速度
• 5.2 多菌灵的残留
• 结论与讨论
• 1 四川食用菌中的病毒DSRNA
• 2 多菌灵在食用菌生产中的作用及其残留
• 参考文献
• 致谢