甜高粱再生体系的优化研究

论文摘要

甜高粱的光合效率是小麦等作物的2-3倍,是目前公认的最具优势的生物质能源作物,可糖、粮兼用,其综合价值高。然而截止目前,甜高粱缺少综合性状优良的品种。利用转基因技术,对现有的甜高粱品种进行定向改良,有望获得高生物量和高抗逆性的新品种。甜高粱再生体系的稳定、高效性在其遗传转化时起到关键作用。本研究以引种至广西南宁种植的北甜三号（BT3）和辽甜三号（LT3）两个甜高粱品种的成熟种子为试验材料,主要优化这两个品种的再生体系,以期获得方便、高效、稳定的甜高粱再生体系,为下一步遗传转化体系的建立奠定良好的基础。目前取得的主要研究结果如下：1优化愈伤组织的诱导首先通过不同植物激素2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、1-萘乙酸（NAA）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）浓度配比的优化试验,得出最优激素组合：BT3为2.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L NAA, LT3为2.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L NAA。在上一步的基础上,再通过不同基本培养基（MS、1/2MS、B5、N6）、不同糖源（蔗糖、葡萄糖、葡萄糖：果糖=3:2）、不同pH值（5.3、5.8、6.3）的优化试验,另外还通过不同浓度硝酸银（AgNO3）（四个水平：2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L）对愈伤组织诱导的影响试验,最终筛选出两品种的最佳愈伤组织诱导配方：BT3为MS+2.0mg/L 2,4-D+0.1 mg/L NAA, LT3为MS+2.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L NAA, pH值5.8、蔗糖为糖源时,胚性出愈率最高,愈伤组织诱导培养基中添加AgNO3不能促进两基因型甜高粱种子愈伤组织的形成,相反却降低了其胚性愈伤组织的诱导。另外,通过愈伤组织的不断继代培养观察,摸索出最适的愈伤组织增殖配方：MS+2.0mg/L 2,4-D+0.5～1.0mg/L NAA,两品种的愈伤组织在此配方上不仅褐化率低,而且增殖快。2潮霉素对甜高粱愈伤组织生长的影响通过在愈伤组织增殖培养基中添加不同浓度（四个浓度梯度：25、50、75和100mg/L）的潮霉素试验,可观察比较得出,75和100mg/L潮霉素处理使BT3和LT3的胚性愈伤组织全部死亡并变为黑褐色。采用这两个浓度潮霉素筛选甜高粱的抗性愈伤组织,将可能会影响转化细胞的正常生长。潮霉素水平为25mg/L时不可以完全地抑制甜高粱胚性愈伤的生长,若用其筛选转化成功的愈伤组织,将不能使许多非转化的愈伤组织死亡。然而当潮霉素的浓度水平为50mg/L时,甜高粱的胚性愈伤可以完全停止生长并最终褐化死亡,但细胞不会大量地快速死亡,因此可以作为BT3和LT3两品种转化细胞筛选的理想浓度。另外,25和50mg/L潮霉素对两品种愈伤组织生长影响的结果为LT3愈伤组织存活率都高于BT3,这说明潮霉素对甜高粱愈伤组织的影响存在基因型差异。3丛生芽诱导的优化通过不同植物激素（6-BA、NAA、2,4-D）浓度配比的优化试验,可比较得出两甜高粱品种丛生芽诱导的最佳激素配比都为MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L 2,4-D,但是它们的丛生芽诱导率有一定程度的差异。另外,通过多次试验观察对比,摸索出适宜两品种的丛生芽增殖配方：MS+1.0mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA,壮苗配方：MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA。4甜高粱组培苗生根的优化首先通过不同基本培养基（MS、1/2MS）对组培苗生根的影响试验,可比较得出1/2MS添加激素更有利于生根；然后再在1/2MS上添加不同浓度的植物激素吲哚丁酸（IBA）、NAA、生根粉,综合根的质量、生根率、生根时间、生根苗的长势等各种因素分析可得最佳生根培养基：BT3为1/2MS+2.0mg/L IBA;LT3为1/2MS+3.0mg/L IBA。未加激素的MS和1/2MS培养基均无组培苗生根。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 生物质能源作物的概况
• 1.1.1 生物质能源作物研究的重要性
• 1.1.2 生物质能源作物的种类和优点
• 1.1.3 国内外生物质能源作物的研究利用现状
• 1.2 能源作物甜高粱的研究利用概况
• 1.2.1 甜高粱的生物学特性
• 1.2.2 国内外甜高粱品种的引进利用概况及发展趋势
• 1.3 再生体系建立技术的应用研究
• 1.3.1 愈伤组织诱导的研究
• 1.3.2 丛生芽诱导的研究
• 1.3.3 组培苗生根的研究
• 1.4 潮霉素筛选体系的原理及应用
• 1.5 研究的目的意义及创新点
• 1.5.1 研究的目的
• 1.5.2 研究的意义
• 1.5.3 本研究的创新点
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 外植体的消毒处理
• 2..2.2 无菌苗根茎叶诱导愈伤组织的研究
• 2.2.3 成熟种子诱导愈伤组织的优化研究
• 2.2.4 愈伤组织的继代研究
• 2.2.5 不同潮霉素处理对甜高粱胚性愈伤的影响
• 2.2.6 三种激素配比对芽诱导的影响
• 2.2.7 丛生芽的增殖及壮苗培养研究
• 2.2.8 组培苗生根培养的优化研究
• 2.3 数据分析方法
• 2.3.1 分析指标
• 2.3.2 差异性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 不同消毒时间对成熟种子的处理效果
• 3.2 根茎叶诱导愈伤的研究
• 3.3 成熟种子诱导愈伤组织的优化
• 3.3.1 2,4-D不同浓度处理对诱导愈伤的影响
• 3.3.2 NAA与2,4-D不同配比处理对诱导愈伤的影响
• 3.3.3 不同6-BA与2,4-D配比处理对诱导愈伤的影响
• 3.3.4 KT与2,4-D不同配比处理对诱导愈伤的影响
• 3.3.5 不同基本培养基处理对诱导愈伤的影响
• 3.3.6 糖源不同处理对诱导愈伤的影响
• 3.3.7 pH值不同处理对诱导愈伤的影响
• 3.3.8 不同浓度AgNO3对诱导愈伤的影响
• 3.4 潮霉素不同浓度处理对胚性愈伤生长的影响
• 3.5 三种激素配比对芽诱导的影响
• 3.6 组培苗生根的优化
• 3.6.1 基本培养基不同处理对生根的影响
• 3.6.2 IBA不同浓度处理对生根的影响
• 3.6.3 NAA不同浓度处理对生根的影响
• 3.6.4 生根粉不同浓度处理对生根的影响
• 4 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.1.1 外植体的消毒
• 4.1.2 根茎叶诱导愈伤的研究
• 4.1.3 成熟种子诱导愈伤组织配方的优化
• 4.1.4 潮霉素不同处理对胚性愈伤的影响
• 4.1.5 丛生芽诱导最佳培养基配方的优化
• 4.1.6 甜高粱组培苗生根条件的优化
• 4.2 讨论
• 4.2.1 外植体的消毒及不同外植体愈伤组织诱导的比较
• 4.2.2 成熟种子诱导愈伤组织最佳培养基配方的研究
• 4.2.3 潮霉素不同浓度水平对胚性愈伤的影响
• 4.2.4 丛生芽诱导的优化
• 4.2.5 甜高粱组培苗生根的优化
• 4.2.6 存在的问题
• 4.2.7 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录