人布鲁氏菌病标准化PCR诊断方法及BP26基因标记疫苗研究

论文摘要

布鲁氏菌病为动物源性疾病,是由细胞内寄生的布鲁氏菌引起的传染-变态反应性人兽共患传染病,在世界范围内广泛流行,对畜牧养殖业的发展和人类健康造成严重威胁,已成为重要的公共卫生问题。布鲁氏菌病的诊断方面存在两个主要的问题:一是快速准确诊断,二是现有减毒活疫苗的鉴别诊断。PCR检测技术避免操作活菌,并能检测到标本中较低丰度的病原,适合布鲁氏菌这种高危险性病原的检测。用PCR方法对布鲁氏菌病早期、复发期以及伴随多种并发症的患者及药物治疗后患者进行诊断,具有较好的应用前景,我国目前尚无应用PCR检测方法在临床诊断上跟踪随访的研究报道。本研究针对布鲁氏菌的保守基因bp26设计了属的引物,针对插入性序列IS711设计了牛、羊、猪种引物,建立了单重和多重PCR检测方法,在临床上对免疫学诊断为患者、可疑患者和非患者人群进行检测,并结合流行病学个案数据库资料拟定了进一步跟踪随访检测的对象,为建立人布鲁氏菌病标准化PCR诊断方法提供研究依据。目前应用血清学方法不能区分布鲁氏菌减毒疫苗株的反应与自然感染,发展基因标记疫苗可解决这一问题。M5是我国广泛应用的减毒活疫苗株,本研究应用基因同源重组方法,用卡那抗性基因替换部分bp26基因,构建了bp26突变株,并根据布鲁氏菌的保守基因建立了能够区分bp26突变株与疫苗株的PCR鉴别方法。bp26突变株在胞内外的生存能力显示,bp26突变株在小鼠体内的免疫应答和免疫保护效果均低于M5疫苗株,表明bp26基因在M5疫苗株的免疫保护作用中发挥了作用。考虑到bp26基因在免疫原性和保护性方面的重要性,我们对BP26蛋白进行了表达及纯化,并致力于开发有效的布鲁氏菌亚单位疫苗和作为人布鲁氏菌病血清学的特异性诊断抗原用于临床诊断研究。

论文目录

• 提要
• 符号说明
• 第1章 绪论
• 1.1 布鲁氏菌病的危害
• 1.2 布鲁氏菌病的流行病学概况
• 1.2.1 布鲁氏菌病原
• 1.2.2 布鲁氏菌病疫情及分布
• 1.2.3 布鲁氏菌病疫情流行特征
• 1.2.4 当前我国布鲁氏菌病人间疫情流行特点和上升原因
• 1.3 人布鲁氏菌病的临床及治疗
• 1.3.1 人布鲁氏菌病的发病机理和病理学改变
• 1.3.2 人布鲁氏菌病的临床表现和临床诊断
• 1.3.3 人布鲁氏菌的治疗和预后
• 1.3.4 人布鲁氏菌的免疫和预防
• 1.4 布鲁氏菌基因多态性
• 1.4.1 布鲁氏菌基因组
• 1.4.2 布鲁氏菌基因多态性
• 1.5 布鲁氏菌病诊断方法概述
• 1.5.1 布鲁氏菌病血清学诊断方法概述
• 1.5.2 布鲁氏菌分离培养方法概述
• 1.5.3 布鲁氏菌病PCR诊断方法
• 1.6 布鲁氏菌病疫苗种类及研究进展
• 1.6.1 布鲁氏菌全菌苗
• 1.6.2 基因工程疫苗
• 1.6.3 亚单位疫苗
• 1.6.4 核酸疫苗
• 1.7 本研究的目的意义及主要研究内容
• 1.7.1 人布鲁氏菌病PCR诊断方法的研究
• 1.7.2 BP26基因标记疫苗的研究
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 样本来源
• 2.1.2 样本数量
• 2.1.3 人布鲁氏菌病诊断标准
• 2.1.4 流行病学个案资料收集
• 2.1.5 菌株、基因组、细胞系、质粒
• 2.1.6 实验动物
• 2.1.7 主要试剂
• 2.1.8 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌液制备、稀释、计数培养方法
• 2.2.2 模拟样本制备方法
• 2.2.3 实验动物接种和采血方法
• 2.2.4 布鲁氏菌分离培养方法
• 2.2.5 血液中布鲁氏菌DNA提取方法
• 2.2.6 引物设计
• 2.2.7 构建bp26突变株的方法
• 2.2.8 bp26突变株与M5疫苗株的鉴别PCR方法
• 2.2.9 巨噬细胞内生存能力分析
• 2.2.10 小鼠体内生存能力分析
• 2.2.11 小鼠免疫保护作用
• 第3章 结果
• 3.1 实验室布鲁氏菌PCR诊断方法研究
• 3.1.1 单一PCR诊断方法建立
• 3.1.2 多重鉴别PCR诊断方法研究
• 3.1.3 单一PCR检测方法敏感性
• 3.2 单一PCR检测方法在临床样本检测中应用
• 3.2.1 对布病门诊收集的冻存血样进行PCR检测
• 3.2.2 临床样本中布鲁氏菌分离培养鉴定情况
• 3.2.3 临床血液样本PCR检测
• 3.3 流行病学个案调查数据库资料（EpiData数据库）分析
• 3.3.1 数据库构成和资料来源
• 3.3.2 分离培养阳性者个案资料分析
• 3.3.3 免疫学诊断为患者、非患者、可疑患者的个案资料分析
• 3.4 M5△bp26突变株的构建与鉴定
• 3.4.1 pUC19K-NC重组质粒构建
• 3.4.2 M5△bp26突变株的构建
• 3.5 M5△bp26突变株与M5疫苗株的PCR鉴别方法
• 3.5.1 BP26和DnaK双重PCR初始扩增条件
• 3.5.2 双重PCR反应体系和反应条件的优化
• 3.5.3 PCR的敏感性
• 3.6 bp26基因在M5疫苗株中的免疫保护作用
• 3.6.1 M5△bp26突变株在巨噬细胞内的生存能力
• 3.6.2 M5△bp26突变株在小鼠体内的存活能力
• 3.6.3 M5△bp26突变株的免疫保护作用研究
• 第4章 讨论
• 4.1 传统布鲁氏菌病诊断方法存在的问题分析
• 4.2 限制PCR检测方法在布鲁氏菌病临床应用的问题分析
• 4.3 流行病学个案数据库在患者追踪随访中的应用
• 4.4 PCR方法在临床诊断应用中的初步评价
• 4.5 M5△bp26突变株构建及与M5疫苗株的鉴别诊断
• 4.6 BP26与布鲁氏菌的毒力可能有关
• 4.7 M5△bp26突变株在小鼠巨噬细胞内的生存能力分析
• 4.8 M5△bp26突变株在小鼠体内的生存能力
• 4.9 M5△bp26突变株和疫苗株的免疫保护效果分析
• 第5章 结论
• 5.1 本研究获得的主要结论
• 5.2 本研究的创新点
• 5.3 本研究尚存在的问题
• 5.4 展望和设想
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract