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c-Abl非受体酪氨酸激酶与FHL2相互作用及其生物学意义

2020-12-07阅读(371)

c-Abl非受体酪氨酸激酶与FHL2相互作用及其生物学意义

论文摘要

c-abl是Abelson小鼠白血病病毒癌基因v-abl在细胞内的同源基因,编码的蛋白c-Abl属于非受体酪氨酸激酶并具有重要的生物学功能,c-Abl通过与底物相互作用参与调控多种细胞活动,包括细胞增殖与分化、细胞黏附迁移、细胞凋亡、细胞转化、细胞周期以及感染与免疫等过程。c-Abl激酶活性被生长因子（EGF、PDGF）激活并参与调控生长因子诱导的细胞DNA合成和相关蛋白因子Cyclin D1、c-Myc的合成,促进细胞生长;c-Abl在离子辐射引起的DNA损伤应激中被激活,参与调控细胞周期和细胞凋亡,但c-Abl具体的下游因子及分子机制没有研究清楚。为了进一步深入研究c-Abl发挥功能的分子机理,我们利用酵母双杂交系统,以全长c-Abl为诱饵蛋白筛选c-Abl相互作用蛋白,发现蛋白质FHL2有可能与c-Abl相互作用,FHL2主要作为转录辅助因子在胚胎发育、细胞增殖与分化中发挥重要作用,与c-Abl在功能上有很多相关性。FHL2作为辅助因子能促进与细胞增殖分化相关的信号通路如AP-1、Wnt/β-catenin和Rho等通路的活性,调控Cyclin D1、c-Myc等细胞因子的表达,促进细胞生长,FHL2的表达在离子辐射中被激活,对于FHL2调控的研究目前还很少。本论文在酵母双杂交实验的基础上,对非受体型酪氨酸激酶c-Abl与FHL2相互作用及在细胞增殖和离子辐射应激中的生物功能进行了研究。首先利用免疫沉淀、免疫印迹、GST-pull down以及Far Western方法证明c-Abl和FHL2在细胞内和体外直接相互作用,通过抗酪氨酸磷酸化抗体的免疫印迹实验证明c-Abl可以使FHL2酪氨酸磷酸化,FHL2是非受体型酪氨酸激酶c-Abl的磷酸化底物;利用点突变的方法发现c-Abl与FHL2的结合位点（第110位和143位脯氨酸）和主要磷酸化位点（第93位和第97位酪氨酸）。进一步研究发现FHL2能提高c-Abl的蛋白表达水平,MCF-7细胞中干扰内源性FHL2的表达会降低c-Abl蛋白的水平,说明MCF-7细胞中内源性的c-Abl蛋白表达依赖FHL2,c-Abl蛋白通过泛素化蛋白酶体途径降解,进一步发现FHL2是通过降低c-Abl蛋白质泛素化水平提高其蛋白稳定性。c-Abl磷酸化FHL2能促进FHL2形成同源二聚体并进入细胞核,FHL2内在转录活性的激活依赖于c-Abl的激酶活性,FHL2的转录活性在c-Abl knockdown的细胞系比野生型细胞中显著降低。生长因子EGF能激活FHL2的转录活性,并依赖于c-Abl及其激酶活性。c-Abl磷酸化FHL2激活FHL2对Wnt/β-catenin信号通路的促进作用,c-Abl与FHL2协同促进Wnt/β-catenin信号通路的活性,调控Wnt/β-catenin信号通路下游因子Cyclin D1等的表达。另外发现c-Abl与FHL2参与调控离子辐射激中细胞周期G2/M期的阻滞,c-Abl和FHL2 knockdown的细胞系,在离子辐射后G2/M期阻滞表现缺陷,通过细胞周期同步化实验进一步证实c-Abl和FHL2 knockdown的细胞系,在离子辐射后G2/M期阻滞的强度和时间都比野生型细胞要弱和短很多。实验发现c-Abl与FHL2能与G2/M checkpoint通路中关键调控蛋白Cdc25C结合调控G2/M checkpoint通路。c-Abl不影响Cdc25C上游激酶Chk1的激活,而能与Cdc25C相互作用,通过体外磷酸酶活性分析实验发现c-Abl能在体外抑制Cdc25C磷酸酶活性,离子辐射后诱导的Cdc2 Tyr15磷酸化的累积依赖于c-Abl和FHL2。本研究通过c-Abl与FHL2的相互作用及生物学意义研究得到如下结论:c-Abl能够直接与FHL2相互作用,结合位点是110位和143位脯氨酸;c-Abl能使FHL2酪氨酸磷酸化,FHL2的第93位和第97位是c-Abl酪氨酸磷酸化的主要位点;FHL2通过降低c-Abl的泛素化水平提高其蛋白稳定性;c-Abl能提高FHL2蛋白稳定性,促进FHL2形成同源二聚体并进入细胞核;c-Abl激活FHL2辅助转录活性,通过FHL2促进Wnt/β-catenin信号通路活性;生长因子EGF通过激活c-Abl激活FHL2转录活性,FHL2作为c-Abl下游因子参与EGF信号传递;c-Abl和FHL2通过Cdc25C调控离子辐射应激中G2/M checkpoint通路,参与调控离子辐射诱导的细胞周期G2/M期阻滞。通过c-Abl与FHL2的相互作用及生物学意义的研究,揭示FHL2作为c-Abl下游因子参与生长因子信号通路,c-Abl通过调控FHL2的转录活性参与调控细胞增殖分化的分子机制;揭示c-Abl与Cdc25C结合抑制Cdc25C磷酸酶活性,调控离子辐射后细胞周期G2/M期阻滞的分子机制,FHL2通过调控c-Abl蛋白稳定性调控离子辐射后细胞周期G2/M期的阻滞。这对深入认识非受体酪氨酸激酶c-Abl和转录辅助因子FHL2在正常细胞和肿瘤细胞中的功能及调控机制具有重要的理论意义。

论文目录

  • 缩略词表
  • 摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 1. FHL2 的结构、功能与调控
  • 2. c-Abl酪氨酸激酶的结构与功能
  • 3. 细胞周期阻滞
  • 4. 本课题研究的科学问题
  • 材料和方法
  • 1. 细胞株、菌株及质粒
  • 2. 分子生物学工具酶
  • 3. FHL2 全长基因的获得
  • 4. 质粒构建
  • 5. 转染质粒的制备
  • 6. 细胞培养、冻存与转染
  • 7. 谷胱甘肽S转移酶（GST）融合蛋白的制备
  • 8. 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）与免疫印迹（Immunoblot，IB）
  • 9. 体外结合实验
  • 10. 蛋白质浓度测定
  • 11. 体外磷酸酶活性分析
  • 12. 荧光素酶活性检测
  • 13. 细胞同步化实验
  • 14. 流式细胞技术检测细胞周期
  • 15. 细胞核、细胞质蛋白分离
  • 16. 细胞中总RNA提取及RT-PCR
  • 17. 其它
  • 结果与分析
  • 1. c-Abl与FHL2 相互作用
  • 2. c-Abl酸磷化FHL2
  • 3. FHL2 促进c-Abl稳定性
  • 3.1 FHL2 促进c-Abl蛋白表达水平
  • 3.2 FHL2 降低c-Abl蛋白泛素化水平
  • 4. c-Abl调控FHL2 的转录活性
  • 4.1 c-Abl促进细胞内FHL2 的稳定性
  • 4.2 c-Abl促进FHL2 形成同源二聚体
  • 4.3 c-Abl促进FHL2 进入细胞核
  • 4.4 c-Abl调控FHL2 辅助转录活性
  • 4.5 c-Abl与FHL2 促进Wnt/β-catenin通路活性
  • 5. c-Abl与FHL2 调控细胞增殖相关因子
  • 6. c-Abl与FHL2 调控细胞周期G2/M期阻滞
  • 6.1 c-Abl与FHL2 调控细胞周期G2/M期阻滞
  • 6.2 c-Abl和FHL2 与Cdc25C相互作用
  • 6.3 c-Abl和FHL2 调控细胞周期G2/M Checkpoint通路
  • 讨论
  • 1. c-Abl酪氨酸激酶与FHL2 之间的相互作用
  • 2. c-Abl酪氨酸激酶磷酸化FHL2 并调控FHL2 的转录活性
  • 3. c-Abl酪氨酸激酶与FHL2 调控细胞周期阻滞
  • 结论
  • 参考文献
  • 发表论文
  • 致谢

    • 相关论文文献

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