幽门螺杆菌粘膜核酸疫苗的制备及免疫学效应研究

论文题目: 幽门螺杆菌粘膜核酸疫苗的制备及免疫学效应研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 临床检验诊断学

作者: 曾韦锟

导师: 邹全明

关键词: 幽门螺杆菌,疫苗,壳聚糖,纳米粒子,佐剂

文献来源: 第三军医大学

发表年度: 2005

论文摘要: 目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)在人群中呈现高感染率,严重危害人类健康。用Hp核酸疫苗预防Hp感染的报道不多,且效果不甚理想。本研究拟构建壳聚糖包裹的Hp粘膜核酸疫苗,采用与抗原共表达细胞因子的方式来增强和调控免疫反应,同时观察疫苗诱导的免疫应答与抗Hp定植之间的关系,进一步揭示疫苗可能的保护性机制。方法:1.以Hp标准株NCTC11637基因组为模板,PCR扩增hpaA及ureB基因,亚克隆至pMD18-T载体,酶切并测序鉴定后,克隆至真核表达载体pTCAE,构建pT-H和pT-U,并分别转化DH5α。抽提质粒电穿孔法转染CHO细胞,间接免疫荧光法及免疫印迹法检测目的蛋白的表达。分别将pT-H、pT-U注射小鼠股四头肌,检测血清中特异性IgG水平。2. RT-PCR法从小鼠脾脏中扩增GM-CSF、IL4基因,亚克隆至pMD18-T载体,酶切并测序鉴定后,将细胞因子基因分别插入pT-U中,构建真核表达载体pT-GU、pT-IU。抽提质粒电穿孔法转染CHO细胞,免疫印迹法检测GM-CSF、IL4的表达,并通过细胞因子依赖细胞测活。3.发酵工程菌DH5α(pT-U),采用裂菌――Q Sepharose XL粗纯化――Source 30 Q精细纯化的方法纯化质粒。经复合物凝聚法制备、比较不同浓度壳聚糖和质粒形成纳米粒子的形状、大小、稳定性,确定适合的浓度搭配。4.发酵工程菌,纯化pT、pT-GU、pT-IU,并制备壳聚糖包裹的纳米粒子。将裸质粒pT-U和壳聚糖包裹的pT、pT-U、pT-GU、pT-IU分别滴鼻或口服免疫BALB/c小鼠,测定小鼠血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgA、粪便抽提物的sIgA,胃组织RT-PCR检测GAPDH、IFN-γ、IL10、mBD1、mBD3的表达水平。将壳聚糖包裹的pT、pT-U、pT-GU、pT-IU分别滴鼻或口服免疫沙鼠,末次免疫后2周灌喂109CFU Hp动物适应株, 4周后检测Hp定植情况。结果:

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论文正文幽门螺杆菌粘膜核酸疫苗的制备及免疫学效应研究

前言

第一部分 ureB、hpaA 基因的克隆及免疫原性的比较

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

第二部分 ureB 与 GM-CSF 或 IL4 双表达核酸疫苗的构建、表达及鉴定

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

第三部分壳聚糖包裹的纳米核酸疫苗的制备及性质分析

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

第四部分核酸疫苗的免疫学效应

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

全文总结

致谢

参考文献

附录

文献综述粘膜核酸疫苗

参考文献

发布时间: 2006-10-19

参考文献

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幽门螺杆菌粘膜核酸疫苗的制备及免疫学效应研究

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