人早孕因子表达与促细胞生长模型的初步建立

论文摘要

早孕因子（early pregnancy factor, EPF）是哺乳动物妊娠早期母体血清中最早出现的一种免疫抑制因子。具有免疫抑制和生长调节两种功能,为目前最早确认妊娠的生化指标之一。小鼠受精后6h,猪、牛、山羊24 h,人受精48 h即可从母体内测出EPF,这些远早于人绒毛膜促性腺激素（hCG）测定,而且EPF的活性可以在妊娠期存在很长时间,因此对EPF的活性检测可用于牛、马的早期妊娠诊断。EPF在孕妇的超早孕诊断中准确率达88.6%,因此,EPF在早孕诊断方面的应用,将对人类及畜牧业有重要的意义。为获得人早孕因子重组蛋白,提取人肝癌SMMC-7721细胞总RNA,对早孕因子基因进行RT-PCR扩增、TA克隆和测序,通过PCR技术扩增人早孕因子基因,克隆入原核表达载体pGEX-6p-1和pET-28a,分别与GST基因和his基因相融合,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌表达菌株BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,以SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的表达,通过GST树脂和纯化表达蛋白。结果成功构建重组表达质粒pGEX6p-EPF,在大肠杆菌中诱导表达了GST-EPF融合蛋白,表达蛋白分子量为37.3 kDa,并能被抗GST单克隆抗体特异识别,通过GST亲和层析纯化,制备得到EPF重组蛋白,pET28-EPF重组质粒成功构建,在大肠杆菌中诱导表达了his-EPF融合蛋白,表达蛋白分子量为17kDa,并能被抗his单抗特异识别,通过镍柱纯化得蛋白。玫瑰花环抑制实验证明了蛋白活性。为研究EPF的生长因子作用,建立EPF对细胞有明显促生长作用的细胞模型,将不同浓度梯度的EPF分别加入Marc145、NSO、PK15、BHK及人肝癌SMMC-7721细胞中,通过显微镜观察和细胞计数判断EPF对细胞数目的影响,发现在Marc145和NSO细胞系中细胞数目有明显增多,初步筛选出Marc145和NSO两种细胞系作为促生长细胞模型。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 早孕因子的研究进展
• 1.2.1 早孕因子:热休克蛋白10的同系物
• 1.2.2 早孕因子的性质和它的激活因子
• 1.2.3 早孕因子和它的目标受体
• 1.2.4 免疫反应中的热休克蛋白10
• 1.2.5 早孕因子的生物学鉴定方法:玫瑰花环抑制试验
• 1.2.6 早孕因子在腹腔注射的时间进程
• 1.2.7 早孕因子诱导基因限制淋巴因子
• 1.2.8 早孕因子是胚胎一个基本的存活因子
• 1.2.9 早孕因子是增生细胞和肿瘤细胞的存活因子和生长因子
• 1.2.10 早孕因子的免疫学特性
• 1.2.11 早孕因子和自身免疫性疾病
• 1.3 早孕因子在临床中的应用
• 1.3.1 胚胎监控
• 1.3.2 超早孕检测
• 1.3.3 肿瘤细胞的早期诊断
• 第二章 人早孕因子基因的克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 质粒、菌种和试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要液体试剂
• 2.1.4 人早孕因子基因的克隆
• 2.2 结果
• 2.2.1 EPF基因的克隆
• 2.2.2 重组表达质粒的PCR和酶切鉴定结果
• 2.2.3 EPF基因cDNA序列
• 2.3 讨论
• 第三章 人早孕因子基因的表达及纯化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 质粒、菌种和试剂
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要试剂盒
• 3.1.5 EPF基因的扩增
• 3.1.6 重组质粒的构建
• 3.1.7 重组质粒的鉴定
• 3.1.8 重组质粒的提取和在表达菌株BL21的转化
• 3.1.9 重组质粒pGEX6p-EPF和pET28-EPF的原核表达
• 3.1.10 重组质粒pGEX6p-EPF最佳诱导条件的优化
• 3.1.11 重组蛋白pGEX6p-EPF表达产物可溶性分析
• 3.1.12 目的蛋白的纯化
• 3.2 结果
• 3.2.1 EPF基因片段的PCR扩增结果
• 3.2.2 重组表达质粒的PCR和酶切鉴定结果
• 3.2.3 重组质粒的诱导表达
• 3.2.4 重组蛋白pGEX6p-EPF表达的时间优化
• 3.2.5 诱导剂浓度对重组蛋白表达量的影响
• 3.2.6 重组蛋白的可溶性表达
• 3.2.7 Western blot检测结果
• 3.2.8 玫瑰花环抑制实验结果分析
• 3.2.9 表达蛋白的纯化
• 3.3 讨论
• 3.3.1 表达系统的选择
• 3.3.2 关于表达载体的选择
• 3.3.3 包涵体形成分析
• 3.3.4 重组蛋白可溶性表达优化
• 3.3.5 重组蛋白的纯化
• 第四章 早孕因子促生长细胞模型的初步建立
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 细胞和试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 主要溶液配制
• 4.1.4 各种细胞传代培养方法
• 4.1.5 细胞计数法
• 4.1.6 EPF促生长细胞模型的建立方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 重组蛋白在Marc145细胞促生长作用
• 4.2.2 重组蛋白在NS0细胞中的促生长作用
• 4.3 讨论
• 第五章 研究总结
• 参考文献
• 附录A:英文缩略词表（Abbreviations）
• 作者简历
• 获得的奖励及主要荣誉
• 硕士在读期间撰写和已发表的论文
• 致谢