单分子水平上的荧光共振能量转移及漂白行为的研究

论文摘要

单分子检测（SMD,Single Molecule Detection）正在生物学、物理学、医学、化学以及纳米材料等前沿领域得到广泛的应用和迅猛的发展。SMD能够检测复杂体系中的个体,尤其是可以研究反应中的中间产物,实时观测反应过程。其中单分子荧光成像技术成为了研究单分子相互作用、单分子动力学过程和生物大分子构象转变的重要工具。利用单分子荧光光谱可以区分复杂的生物体系中被不同的荧光基团标记的生物大分子。本论文对单分子对荧光共振能量转移（spFRET,single pair Fluorescence Resonance Energy Transfer）的研究就是利用单分子荧光光谱实现了单通道内检测分子之间的荧光共振能量转移。荧光染料通常被标记在生物大分子上,以对其进行定位和示踪。但是荧光漂白现象却是荧光染料广泛应用的一个巨大的障碍,所以如何抑制光漂白成为研究的重点,但是却鲜有研究单个荧光染料分子漂白前光强度的变化。本论文基于普通宽场落射式荧光显微镜观测了双标记的病毒的外壳和DNA;构建了一个单通道内观测spFRET的平台;探究了多种荧光染料分子的漂白行为。具体内容如下:1、单通道内观测spFRET。在电子耦合倍增管（EMCCD）芯片的前方添加一块透射光栅,利用透射光栅的分光作用,根据不同的荧光物质被光栅分光后零级点到一级条纹之间的距离不同的原理,用一块双通滤光片作为滤光块的发射滤光片只允许供受体发射光通过,供体被激发以后受体也发出荧光被最终呈现一个零级点和两条一级条纹。分别以Streptavidian-Alexa594、Atto488-biotin和Cy3、Cy5为研究对象,实现了单通道内检测单对荧光共振能量转移。2、单个荧光染料漂白行为的研究。对罗丹明B、Alexa fluor、YOYO-1染料在荧光漂白前荧光强度的变化进行分析,得出这几种荧光染料分子在荧光漂白前的强度变化是一个随时间变化的线性函数,并且这个函数的斜率服从洛伦兹分布。考察了不同极性溶剂和不同pH值溶剂对其荧光强度变化的影响。并且发现长波长光对荧光染料分子同样具有光漂白作用。3、病毒外壳和DNA链的双标记。先将一种荧光染料标记在腺病毒的外壳上,病毒裂解后,用嵌入式荧光染料（YOYO-1）标记病毒释放的DNA。实现普通宽场显微镜下观测单个病毒及其裂解产生的核酸,为将来在微流控通道中和细胞内动态观测病毒释放DNA的过程打下了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 插图索引
• 附表索引
• 第1章 绪论
• 1.1 单分子荧光成像检测法
• 1.1.1 宽场成像
• 1.1.2 扫描成像
• 1.2 单个荧光分子的特性与单个量子点的判定
• 1.2.1 单分子荧光产生的原理
• 1.2.2 单分子的荧光特性以及判定依据
• 1.2.3 单分子荧光检测的技术关键
• 1.2.4 单分子荧光检测的技术手段
• 1.3 荧光探针
• 1.3.1 有机荧光染料
• 1.3.2 量子点
• 1.4 荧光共振能量转移
• 1.4.1 供受体对的选择
• 1.4.2 spFRET 的应用
• 1.5 单分子漂白行为的研究
• 1.6 病毒示踪的研究
• 1.7 本论文的研究构想与主要内容
• 第2章 单分子荧光共振能量转移
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验仪器和试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 SA-Alexa594 和Biotin-Att0488 之间的FRET
• 2.3.2 单对荧光共振能量转移（spFRET）
• 2.4 小结
• 第3章 单分子荧光漂白行为的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂与仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 单个染料分子荧光强度随时间的变化
• 3.3.2 罗丹明B 在不同极性溶剂中斜率分布
• 3.3.3 罗丹明B 在不同pH 溶液中的斜率分布
• 3.4 长波长的光对单个染料分子的光漂白
• 3.5 小结
• 第4章 病毒外壳和DNA 的双标记
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验仪器和试剂
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.3 标记度的计算
• 4.2.4 病毒的裂解
• 4.2.5 病毒DNA 的标记
• 4.2.6 制片观察
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 染料标记病毒外壳的成像
• 4.3.2 YOYO-1 标记病毒DNA 的成像
• 4.3.3 量子点标记病毒成像
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A 攻读学位期间所发表的论文及专利
• 致谢