蛋白激酶CK2α在大肠癌发生和发展中的作用及机制研究

论文摘要

研究背景大肠癌（Colorectal Cancer）是常见的恶性肿瘤之一,近十年来,大肠癌在我国的发病率呈逐年上升的趋势。由于大肠癌早期症状通常不明显,多数患者确诊时已属中晚期；约四分之一患者首诊时就已出现转移；近一半确诊患者最终将发生转移。因此,筛选和鉴定在大肠癌发生及发展过程中起重要作用的关键基因,阐明肿瘤发生及发展机制,寻找早期诊断的肿瘤标志物和抗肿瘤的药物靶点,是提高大肠癌患者生存率和治愈率的关键问题,也是当代肿瘤研究的迫切任务。在前期研究中,我们以人大肠癌组织及其大肠正常粘膜组织为研究对象,采用高通量的Affymetrix mRNA表达谱芯片,筛选出1950个大肠癌发生发展相关基因,其中包括1180个上调基因,770个下调基因。应用文献轮廓挖掘微阵列表达数据的生物信息学方法,筛选出12个基因（CK2α、MMP28、PINK1、及CEACAM1等）与大肠癌发生发展密切相关。在这些基因中,我们发现了一个非常感兴趣的基因-蛋白激酶CK2α（Protein kinase CK2α）,并对其在大肠癌和正常大肠粘膜组织中的表达运用免疫印迹方法进行了初步验证,其结果与芯片一致。蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在和高度保守的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶,它由两个催化亚基（α和/或α’）和两个调节亚基β构成。人CK2α亚基具有不依赖第二信使或磷酸化的高活性。CK2a亚基的基因结构特点和氨基酸序列进化的高度保守性都有力地说明了CK2a基因可能具有重要的生理功能。近年来研究证实,CK2a基因在细胞增殖、分化、代谢、运动及癌基因和抑癌基因的调节等方面发挥着重要作用。早在1995年Seldin等就在Science报道了CK2在淋巴瘤发生中的作用。这一实验首次证明了CK2在该肿瘤发生中的因果关系并提出了CK2α亚基具有癌基因作用的观点。此后,在肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤中证实CK2α具有促进肿瘤发生及转移的作用。CK2α可明显促进p53杂合子和p53纯合子（p53+/-和p53+/+）敲除的小鼠胸腺淋巴瘤的发生。在人乳腺癌细胞中,Her-2/neu基因受CK2α活性的调控。提高CK2α的活性,可促进Her-2/neu基因介导的细胞增殖,诱导乳腺癌的发生。CK2基因可增力（?）IKK-i/IKKε的mRNA和蛋白表达水平,推测CK2α可能通过诱导形成有功能的IKK-i/IKKε,上调NF-κB的活性,激活NF-κB信号通路,促进乳腺癌的转移。以上研究表明,CK2α是多种肿瘤的促癌基因,其可通过介导细胞内信号传导通路在肿瘤发生及转移中发挥重要作用。目前CK2α在大肠癌中的研究很少,其在大肠癌发生和发展中的作用及作用机制仍有待进一步研究。研究目的本研究着重探讨CK2a基因在大肠癌发生及发展中的作用,确定其与大肠癌发生及发展的关系；阐明CK2a基因在大肠癌发生及发展中可能的作用机制,为大肠癌发生及发展理论提供新的理论依据。方法本研究采用免疫印迹及免疫组化技术检测大肠癌细胞和组织、大肠腺瘤组织及正常的大肠粘膜组织中CK2a的表达并探讨其与患者临床病理参数的关系,初步确定CK2α与大肠癌发生及发展的关系；其次,运用RNA干扰技术研究CK2α基因在大肠癌细胞增殖、细胞周期、衰老、迁移及侵袭中的作用,探讨CK2α基因的表达对大肠癌细胞生物学特性的影响；最后,利用免疫荧光和免疫印迹技术阐明CK2α基因在大肠癌发生及发展中可能的作用机制。结果第一部分CK2α在大肠腺瘤组织、大肠癌组织和细胞中的表达及其与患者临床病理参数的关系通过免疫组化和免疫印迹技术分别检测大肠癌细胞株、大肠癌组织、大肠腺瘤组织和正常大肠粘膜组织中CK2α蛋白的表达情况。我们运用免疫组化方法检测了104例大肠癌组织、40例大肠腺瘤组织和86例正常大肠粘膜组织中CK2a蛋白的表达,结果显示：CK2α蛋白在86例正常大肠粘膜组织中仅有11例呈阳性表达,阳性率为12.8%；40例大肠腺瘤组织中有17例组织呈阳性表达,阳性率为42.5%；而在104例大肠癌组织中有61例呈阳性表达,阳性率为58.7%。卡方检验结果显示：CK2α蛋白在大肠癌组织中的表达高于大肠腺瘤组织,而大肠腺瘤组织中的表达高于正常大肠粘膜组织（x2=42.035,P=0.000）。运用免疫印迹方法我们验证了8对大肠癌组织及其正常大肠粘膜组织和5种大肠癌细胞株中CK2a蛋白的表达,结果显示：CK2α蛋白在大肠癌组织中的表达高于正常大肠粘膜组织,且其在5种大肠癌细胞株中均表达。对大肠癌中CK2α免疫组化结果与患者临床病理参数综合分析,我们发现：CK2a在T3-4期大肠癌中的阳性表达率（72.7%）显著高于T1-2期者（57.1%）（x2=9.534,P=0.002）。CK2α蛋白表达与性别、年龄、肿瘤定位、临床分期等其它临床病理参数无关（P>0.05）。综上所述,我们发现CK2a在大肠癌组织和细胞中均高表达,而在正常大肠粘膜组织中低表达或不表达；CK2α在大肠癌组织中的表达最高,在大肠腺瘤组织中次高,而在正常大肠粘膜组织中最低,且CK2α的表达与大肠癌浸润深度密切相关。因此我们推测CK2α基因是一个重要的大肠癌促癌基因,其可能对大肠癌的生物学行为产生重要影响。第二部分沉默CK2a的表达对大肠癌癌细胞生物学特性的影响采用RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术沉默CK2a表达,利用肿瘤体外实验观测CK2a基因水平下调后大肠癌癌细胞生物学行为的变化。免疫印迹方法检测干扰CK2a基因表达后其蛋白表达情况的变化,验证干扰效率。结果显示：CK2a特异的siRNA干扰片段转染大肠癌细胞株后,细胞内CK2a蛋白的表达明显下降,干扰效率为70%左右。MTT实验结果显示：CK2a基因沉默后细胞增殖率下降,差异显著（F=208.051,P<0.001）。克隆形成实验结果显示：CK2a表达沉默后细胞克隆形成数减少,差异显著（t=20.252,P=0.001）。细胞衰老实验发现沉默细胞中CK2α的表达能促进细胞发生衰老（t＝-13.890,P＝0.001）。细胞周期检测结果显示：沉默CK2α表达后,G0/G1期的细胞比例增加（t=-9.577,P=0.003）,而S期的细胞比例降低（t=8.749,P=0.004）,提示CK2a沉默诱导大肠癌细胞发生Go/G1期阻滞。细胞划痕实验结果显示：沉默CK2a后大肠癌细胞的迁移能力明显减弱,差异显著（F=160.886,P<0.001）。细胞体外侵袭实验发现CK2a表达下调后细胞穿膜数显著降低（t=5.955,P=0.025）,说明CK2a沉默抑制细胞的侵袭能力。以上实验结果充分说明,沉默CK2a的表达显著抑制大肠癌细胞的体外增殖、迁移及侵袭的能力,诱导细胞发生Go/G1期阻滞,促进细胞衰老。CK2a与大肠癌细胞的增殖及侵袭能力密切相关,是大肠癌的促增殖和促侵袭基因。第三部分CK2a调控大肠癌发生及发展分子机制的初步探讨为探讨CK2a在大肠癌发生及发展中的作用机制,我们运用细胞免疫荧光方法,观察沉默CK2a基因后大肠癌细胞内上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal Transition, EMT）相关蛋白E-cadherin（E-钙黏蛋白）、β-catenin（p-连环素蛋白）、vimentin（波形蛋白）的定位及表达情况。结果显示：沉默CK2α基因后,细胞内上皮表型的蛋白E-cadherin的荧光表达明显增强；上皮表型的另一个蛋白β-catenin的定位发生改变,其从细胞核转运到细胞浆；而间质表型的蛋白vimentin的荧光表达明显减弱。运用免疫印迹方法我们进一步检测了沉默CK2a基因后大肠癌细胞中EMT相关蛋白E-cadherin、β-catenin、vimentin表达的变化,同时还检测了增殖相关蛋白p53、p21及C-myc的表达。结果发现：沉默大肠癌细胞内CK2a基因的表达后,E-cadherin蛋白的表达明显增加；vimentin蛋白表达明显下降；β-catenin蛋白表达较前无明显变化,这与免疫荧光的结果相一致。此外,增殖相关蛋白p53和p21的表达明显增加,而另一增殖相关蛋白C-myc的表达降低。以上结果证实,CK2a可调控EMT相关蛋白如E-cadheri、β-catenin、vimentin的表达或定位的改变以及增殖相关蛋白p53、p21及C-myc的表达,参与上皮间质转化过程,影响大肠癌细胞的生物学特性,促进大肠癌的发生及发展。结论CK2a是大肠癌的促癌基因,其在大肠癌发生及发展过程中起重要作用。CK2a可能成为大肠癌分子靶向治疗的有效靶点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 CK2α在大肠腺瘤组织、大肠癌组织和细胞中的表达及其与患者临床病理参数的关系
• 1 材料与方法
• 1.1 细胞系
• 1.2 临床标本采集
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 主要溶液配制
• 1.6 细胞培养
• 1.7 蛋白提取
• 1.8 改良Bradford法测量蛋白浓度
• 1.9 免疫印迹
• 1.10 免疫组化方法检测CK2α表达及结果判断
• 1.11 数据分析及统计方法
• 2 结果
• 2.1 CK2α在5种不同大肠癌细胞株中的表达
• 2.2 CK2α在8对不同大肠癌组织及其癌旁正常大肠粘膜组织中的表达
• 2.3 免疫组化方法检测CK2α在正常大肠粘膜、大肠腺瘤和大肠癌组织中的表达
• 2.4 CK2α的表达与大肠癌患者临床病理参数的关系
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 沉默CK2α的表达对大肠癌癌细胞生物学特性的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 细胞培养
• 1.5 干扰片段的设计及合成
• 1.6 细胞转染
• 1.7 免疫印迹
• 1.8 噻唑蓝（MTT）比色实验检测细胞增殖能力
• 1.9 平板克隆形成实验
• 1.10 β-半乳糖苷酶染色实验检测细胞衰老
• 1.11 细胞周期检测
• 1.12 细胞划痕实验
• 1.13 体外侵袭实验
• 1.14 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 免疫印迹方法检测CK2α基因的干扰效率
• 2.2 CK2α下调对细胞增殖能力的影响
• 2.3 CK2α下调对细胞克隆形成能力的影响
• 2.4 CK2α下调对细胞衰老的影响
• 2.5 CK2α下调对细胞周期的影响
• 2.6 CK2α下调对细胞迁移能力的影响
• 2.7 CK2α下调对细胞侵袭能力的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 CK2α调控大肠癌发生及发展分子机制的初步探讨
• 1 材料与方法
• 1.1 细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 表皮生长因子（EGF）刺激细胞生长
• 1.5 免疫荧光
• 1.6 免疫印迹
• 2 结果
• 2.1 免疫荧光检测CK2α干扰后EMT相关蛋白的定位及表达情况
• 2.2 免疫印迹方法检测CK2α干扰后EMT相关蛋白表达的变化
• 2.3 免疫印迹方法检测增殖相关蛋白的变化
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 中英文缩略语对照表
• 攻读硕士学位期间发表的文章
• 致谢
• 统计学审稿证明