骨髓间充质干细胞治疗顺铂所致大鼠在体卵巢化疗性损伤的实验研究

论文摘要

研究背景卵巢早衰（Premature Ovarian Failure, POF）是指月经初潮正常或青春期延迟、第二性征发育正常的女性,在40岁以前出现持续性闭经和性器官萎缩,并伴有卵泡刺激素（follicle stimulating homone, FSH）和黄体生成素（luteinizing hormone, LH）升高、雌激素（estradiol）降低的综合征。原发闭经中POF占10%-28%,继发闭经中POF占4%-18%。国内报道发病率为1%-3.8%,国外报道POF发病率为1%,近10年来卵巢早衰在育龄妇女中的发生率有逐年升高且向低龄化发展的趋势。POF危害妇女健康,导致一系列生殖内分泌及健康问题。它们的确切病因不清,彻底治疗较为困难,已日益受到重视。腹腔化疗（Intraperitoneal chemotherapy, IPC）是依据一些肿瘤嗜盆腹腔内种植转移的生物学特性,向腹腔内灌注抗癌药物,以治疗盆腹腔恶性肿瘤的-种区域性化疗方法,其在卵巢癌治疗上的应用已有40多年的历史。顺铂（Cisplatin,CDDP）属重金属络合物药物,其抗肿瘤作用机理是将所含氮离子解离后与DNA形成单链内两点或链间的交叉联接,破坏DNA结构和功能,抑制细胞有丝分裂与增殖,为一种细胞周期非特异性药物,是目前应用最多的抗癌药,抗癌谱较广。顺铂的分子量较大（300）,在水中溶解度低,腹腔给药后腹腔液中药物有效浓度高,对腹膜刺激小,成为卵巢癌腹腔化疗中应用最广的化疗药物之一。骨髓间充质干细胞（Mesenchyma stem cells, MSCs）的研究已成为近年来一个热点。其在造血干细胞移植,移植物抗宿主免疫排斥反应（GVHD）,组织损伤与修复、炎症反应、心肌梗死、神经细胞再生中发挥了重要作用。骨髓间充质干细胞以其具有多向分化潜能、来源充足、体外易扩增、无免疫排异等优点,成为再生医学细胞移植治疗重要的种子细胞。干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,在一定条件下,它可以分化为多种功能细胞,根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。就分化能力而言,胚胎干细胞最具临床应用前景,但其来源不足、体外培养困难、定向诱导存在许多技术问题,用于临床存在伦理学问题；而成体干细胞来源丰富、取材方便,可避免社会伦理争论,因此,成体干细胞的研究和应用开发具有重大现实意义。造血干细胞和间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是主要的成体干细胞,其中,MSCs主要存在于结缔组织和器官间质中,以骨髓中含量最为丰富。PKH26是一种高效脂肪族报告分子,这些分子顶端有荧光素或放射性同位素分子群,与细胞浆膜双脂层结合可达到标记细胞的目的,这种探针一旦与细胞膜结合便不易脱离。PKH26荧光染料的激发峰值在488mm,发射峰值在503nm。PKH26可被用于标记神经元细胞、神经胶质细胞、细菌、酵母、淋巴细胞、单核细胞、红细胞、内皮细胞,以及来源于肿瘤或正常组织培养的细胞。PKH26的荧光强度随着被标记细胞的分裂均匀地分配到子细胞中,流式细胞仪能容易地量化荧光衰减的程度。这种染料能高效监测造血干细胞在体内归巢、增殖。除暴露在激发灯光下PKH26标记的细胞会稍引起光毒性外,这种染料几乎对细胞无毒性作用。因此,适合作为一种报告分子来研究细胞在生物体中的分化、定位和转运等。本课题拟通过摸索腹腔注射顺铂导致大鼠在体卵巢损伤的剂量,建立卵巢早衰的模型；建模后向早衰的卵巢内移植PKH26标记的骨髓间充质干细胞,以此观察骨髓间充质干细胞对化疗后大鼠在体卵巢功能的影响,以确定其对化疗后卵巢功能是否有一定的改善作用。第一部分顺铂所致大鼠卵巢损伤动物模型的建立目的：观察不同剂量的顺铂（cisplatin, CDDP）引起大鼠在体卵巢结构和内分泌功能损伤的情况,确定一个适宜浓度,作为建立顺铂所致大鼠卵巢损伤动物模型的剂量,并用于下一步的实验研究。方法：以Wistar雌性大鼠为研究对象,把符合实验标准的56只大鼠随机分为4组,每组14只,分别为实验对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。于实验开始的第1、第8天给予低、中、高剂量组大鼠腹腔注射不同剂量的顺铂溶液3mg·kg-1、4.5mg·kg-1、6.0mg·kg-1),实验对照组于相同时间注射5%葡萄糖溶液1ml。给药后观察大鼠活动、进食、体重及动情周期,全部大鼠在不同时间点（第1次给药前、8d后第2次给药前、12d、30d、45d、60d、75d）经尾静脉取血1ml测雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）,同时于给药后8d、12d、30d、45d、60d、75d备组分别处死2只大鼠,取其卵巢行病理切片,观察卵巢形态学及各级卵泡数的变化。给药后45d（即建模成功后33d）,各组取剩下的2只大鼠与雄性Wistar大鼠合笼,观察顺铂对大鼠远期生殖能力的影响。结果：（1）给药前,4组大鼠体重无统计学差异（F=2.013,P=0.124）,给药后各剂量CDDP（?）大鼠体重均呈不同程度的下降趋势,食欲较给药前下降,中剂量组及高剂量组大鼠体重在给药后明显下降,第8、1 2、15天各组间体重有显著差异（F=28.453、102.364和130.306,P均为0.000）。（2）用药后,实验对照组大鼠动情周期仍规律；低剂量组大鼠虽有完整的动情周期,但延长至8～9天；中、高剂量组大鼠则出现动情周期紊乱,长时间停滞于动情间期,偶见动情后期。给药后30天低剂量组恢复正常的动情周期；中剂量组约于给药后第45天重新出现延长的动情周期,但直至给药后2月仍未恢复至给药前水平；高剂量组则一直表现为动情周期紊乱,以动情间期为主。（3）给药前各组大鼠FSH、E2水平无统计学差异（F分别为0.151和0.433,P分别为0.928和0.730）。中、高剂量组于给药后先后出现高FSH及低E2水平,给药后第12天FSH分别为4.40±0.85 U·L-1、4.91±0.93 U·L-1, E2分别为48.33±16.97pg·ml-1、29.36±12.34pg·ml-1,与实验对照组相比有统计学差异（P<0.05）,而高剂量组高FSH水平持续至给药后第75天,与实验对照组相比仍有统计学差异（P=0.004）。（4）给药后第12天镜下可见各CDDP组总卵泡数少于实验对照组,整体而言各组间有显著差异（F=92.523,P=-0.000）,其中,中、高剂量组卵泡计数与实验对照组相比有显著差异（P均为0.000）。（5）各组剩下的2只大鼠与Wistar公鼠合笼,实验对照组、低剂量组和中剂量组大鼠（共6只）分别于合笼后第23.5天、28.0天、39.0天成功分娩出共26只、25只、9只乳鼠,而高剂量组大鼠合笼后2个月仍无1例妊娠。结论：分别于第1、8天腹腔注射6mg·kg-1（?）铂能引起大鼠卵巢功能明显衰退,生殖能力受损,但代谢机能未受明显影响。该方案建立卵巢早衰动物模型的成功率高,造模周期较短,结果可靠,可以作为基础研究的动物造模。第二部分全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记目的：探讨采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）以及PKH26对其体外标记的方法。方法：通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞。经传代扩增,细胞进一步纯化。取第3代大鼠MSCs按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果。利用四唑盐比色（MTT）法测定标记后MSCs的生长曲线。结果：全骨髓培养分离法培养细胞3天后可观察到细胞形成多个集落样分布的克隆集团,折光性差。第4天左右可观察到细胞数量明显增多,细胞形态丰富,突起形似树枝状增长增粗,细胞排列呈网状。细胞贴壁面积达80%～90%时,细胞排列紧密,呈旋涡状或鱼群状。传至第3代已可得到纯度较高的MSCs。流式细胞仪检测第3代MSCs勺CD29、CD44、CD90均呈高表达。PKH26标记MSCs后,染料在细胞膜上分布均匀、一致,生长形态未发生改变,传代扩增至第3次后,红色荧光在细胞膜上逐渐减弱,呈颗粒状的光点分布。随着传代次数的增多,PKH26标记的细胞荧光强度逐渐减弱。MTT法检测细胞增殖能力发现PKH26标记后MSCs生长曲线与未标记细胞比较无明显统计学差异。结论：全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的MSCs, PKH26荧光标记大鼠MSCs是一种有效、实用的方法,该方法对MSCs移植治疗研究具有重要的价值。第三部分骨髓间充质干细胞对化疗后大鼠卵巢功能的影响目的：用PKH26标记后的MSCs注射至造模后的大鼠双侧卵巢部位,观察卵巢结构及内分泌功能变化情况,探索MSCs治疗化疗所致卵巢损伤的可行性及疗效,为临床上延缓女性生理机能衰老、治疗因化疗引起的不育或过早停经进行实验研究。方法：将88只雌性Wistar大鼠随机分为四组,每组各22只。①实验组；②实验对照组；③单纯造模组；④空白组。空白组不给任何药物处理,①②③组均采用同一方法及相同剂量建立化疗性卵巢衰竭模型,具体方法见前所述：实验开始后,分别于第1、8天腹腔注射6mg·kg-1（?）铂。建模后单纯造模组不予任何处理；第13天,实验组及实验对照组均予开腹行双卵巢局部注射,实验组注射PKH26标记后的MSCs;实验对照组注射生理盐水O.1ml。从实验开始到结束,四组大鼠每天行阴道涂片。实验组于实验开始前、移植细胞前（即第1次给药后第12天）、移植细胞后第15、30、45和60天,各取5只大鼠经尾静脉取血1ml（待测FSH、E2）并处死留取卵巢,其他3组于上述相应时间点行相同处理。所有标本均分别行石蜡包埋及冰冻切片,苏木素-伊红（Hematoxylin-Yihong, HE）染色,比较卵巢重量及卵泡数量变化,冰冻切片荧光显微镜下观察荧光强度变化情况。实验组细胞移植后30天,每组各取2只大鼠与公鼠合笼,观察生殖能力的差异。结果：1.空白组大鼠整个实验过程中阴道涂片均呈正常动情周期改变,其它三组大鼠在给CDDP后则表现为动情周期紊乱。实验组23.53%（4/17只）大鼠移植细胞后第30天开始出现完整动情周期,约6-8天,其余大鼠随着时间推移亦逐渐出现完整动情周期。实验对照组、单纯造模组大鼠至停药第60天,动情周期仍未恢复。2.实验开始前至实验结束,空白组大鼠性激素水平未发生明显变化。造模后移植MSCs前实验组、实验对照组及单纯造模组三组大鼠的FSH和E2浓度相互比较,差异均无统计学意义（F分别为0.195和0.052,P=0.826和0.950）,但整体而言,四组均数间均有统计学意义（F分别为5.309和7.207,P分别为0.010和0.003）。移植MSCs后第15天,实验组大鼠的FSH浓度已从移植前的（5.11±1.22）U·L-1下降至（4.84±0.49）U·L-1,低于实验对照组和单纯造模组水平（5.60±1.60及5.73±1.41）U·L-1,但仍高于空白组水平（3.03±0.72）U·L-1；同期实验组E2浓度为（55.12±9.09） pg·ml-1,高于本组建模后移植MSCs前水平（28.98±6.10）pg·ml-1也高于同期实验对照组和单纯造模组水平（30.79±6.02入27.23±9.69） pg·ml-1,但仍低于同期空白组水平（65.76±21.06） pg·ml-1;实验组与其它三组比较,差异均有统计学意义（F分别为5.803和11.390,P分别为0.007和0.002）。MSCs移植后第30天,实验组大鼠的FSH浓度为（4.33±1.09）U·L-1,较移植后15天有所下降,更低于实验对照组和单纯造模组水平（5.98±1.09和6.33±1.51）U·L-1,但仍高于空白组水平（3.12±1.02）U·L-1；同期实验组E2浓度较前有所升高,为（56.52±8.70） pg·ml-1,仍低于同期空白组（64.14±26.61） pg·ml-1,而同期实验对照组和单纯造模组仍在（23.21±9.61和26.21±13.62） pg·ml-1司徘徊。实验组与其它三组分别比较,差异均有统计学意义（F分别为7.893和8.179,P均为0.002）。MSCs移植后第45天实验组FSH浓度为（3.95±1.13）U·L-1,仍高于空白组（2.77±1.18）U·L-1,更低于实验对照组和单纯造模组水平（6.09±1.27和6.67±0.92）U·L-1；实验组同期E2浓度更为升高,为（66.51±11.23） pg·m-1,仍低于同期空白组（67.25±22.07） pg·m-1,而同期实验对照组和单纯造模组仍在（28.59±6.80和25.25±0.67） pg·m-1间徘徊。实验组与其它三组分别比较,差异均有统计学意义（F分别为12.951和13.433,P均为0.000）。MSCs移植后60天,实验组FSH浓度已降至（3.59±0.99）U·L-1,虽仍高于同期空白组浓度（3.13±1.24）U·L-1及本组给药造模前浓度（2.97±1.23）U·L-1,但差异已无统计学意义（P分别为0.458和0.411）；同期实验组E2浓度（64.57±14.52） pg·ml-1亦虽低于空白组E2 （69.25±15.06） pg·ml-1及本组给药造模前浓度（72.24±23.86） pg·ml-1,但也无统计学差异（P分别为0.566及0.527）。3.移植MSCs后第15天,实验组卵泡总数（44.40±4.45）个高于实验对照组（30.40±7.60）个及单纯造模组（30.80±8.84）个,差异均有统计学意义（P<0.05）,低于同期空白组（67.20±7.76）个,差异亦有统计学意义（P<0.05）。移植后第60天,实验组卵泡数量（33.20±8.08）个,更高于实验对照组（15.80±2.39）个及单纯造模组（15.60±2.79）个,差异仍均有统计学意义（P<0.05）,此时实验组卵泡数仍低于空白组（58.60±3.91）个,差异有统计学差异（P<0.05）。4. MSCs移植后15天,荧光显微镜下观察卵巢冰冻切片,见MSCs集中于卵巢间质部,周围可见部分散在的标记细胞。MSCs移植后30天,镜下仍可见红色荧光,且荧光较15天时稍均匀散开,但荧光强度已有减弱。MSCs移植后45、60天,荧光呈逐渐减弱趋势。四个时间点均未见卵母细胞显红色荧光。5. MSCs移植后30天,实验对照组（n=2）及单纯造模组（n=2）大鼠与公鼠合笼后2个月无1例妊娠,空白组大鼠（n=2）与公鼠平均合笼21.0天后,娩出共24只乳鼠,而实验组大鼠在与公鼠平均合笼31.5天后,娩出共13只乳鼠。结论：骨髓间充质干细胞（MSCs）可以部分改善化疗后大鼠卵巢功能：1.顺铂能致雌性大鼠E2减少,MSCs移植于大鼠卵巢后,E2有所回升,可能是MSCs抑制了分泌E2的颗粒细胞过度凋亡,延缓了卵泡的闭锁,从而减少顺铂对在体卵巢的损伤；2.MSCs可能通过修复卵巢间质,防止卵巢纤维化,从而对化疗性损伤的卵巢起到保护作用,使大鼠的生殖能力免受损害；3.MSCs治疗化疗损伤性在体卵巢的具体详细机制,尚需进一步深入的研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 顺铂所致大鼠卵巢损伤动物模型的建立
• 一、目的和意义
• 二、材料和方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 五、结论
• 第二部分 全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH #26标记
• 一、目的和意义
• 二、材料和方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 五、结论
• 第三部分 骨髓间充质干细胞对化疗后大鼠卵巢功能的影响
• 一、目的和意义
• 二、材料和方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 五、结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 中英文对照缩略词表
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 统计学证明