嗜热酯酶APE1547的立体选择性研究

论文摘要

嗜热酯酶APE1547是深海古菌Aeropyrum pernix K1的嗜热酯酶APE1547基因工程菌高效表达的一种酶,它具有极好的生物学稳定性、高温酯酶活性和较低的立体选择性。在医药、食品和化工等领域具有很大的应用价值。利用嗜热酯酶APE1547拆分乙酸2-辛酯,其立体选择性E值约等于2,为了提高嗜热酯酶APE1547的立体选择性,本文采用了定向进化、定点突变和有机溶剂处理的方法。本研究利用计算机软件优化嗜热酯酶APE1547作用的底物,进行计算机酶—底物复合物建模,最终以能量最小化模型来分析不同小分子底物选择性差异的结构基础;建立了选择性培养基与pH指示剂相结合的两步高通量的筛选方法,筛选定向进化和定点突变的突变库,获得立体选择性E值提高1.8—10倍不等的突变体酶;分析可能引起立体选择性和其它酶学性质改变的酶分子结构基础,确定引起立体选择性提高的可能结构变化,为进一步研究该酶的结构与功能的关系,提供了实验依据;根据嗜热酯酶耐热、耐有机溶剂的特点,加热除去部分杂蛋白后,利用丙酮处理嗜热酯酶及其突变体,提高该酶的活性和立体选择性。此方法最大的优点是简单易行、酶处理时间较短、效果显著,为实现其产业化奠定了基础。

论文目录

• 第一章 前言
• 第一节 嗜热酯酶 APE1547 简介
• 1.1 嗜热酯酶APE1547的来源及特性
• 1.2 嗜热酯酶APE1547的结构特点
• 1.3 嗜热酯酶APE1547的催化机制
• 1.4 嗜热酶酯APE1547的应用前景
• 第二节 生物催化反应的手性化学
• 2.1 生物催化反应的选择性
• 2.2 生物催化选择性反应的主要类型和机制
• 2.3 影响生物催化反应的手性化学因素
• 2.4 生物催化反应手性化学的应用
• 第三节 酶结构与立体选择性关系研究
• 3.1 酶结构稳定的因素
• 3.2 酶结构与立体选择性关系研究进展
• 第四节 调节和改善酶催化活性及立体选择性的方法
• 4.1 酶分子定向进化
• 4.2 合理设计定点突变酶分子
• 4.3 物理化学方法
• 第五节 本论文的研究背景及设计思想
• 5.1 研究背景
• 5.2 设计思想
• 参考文献
• 第二章 定向进化提高嗜热酯酶 APE1547 的立体选择性
• 引言
• 第一节 易错PCR方法构建嗜热酯酶突变库
• 1 实验材料和方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 实验菌株
• 1.4 实验用质粒
• 2 实验方法
• 2.1 溶液配制
• 2.2 培养基
• 2.3 菌种的复活及扩大培养
• 2.4 质粒 DNA 的小量制备
• 2.5 琼脂糖凝胶中回收 DNA
• 2.6 引物设计
• 2.7 易错 PCR 方法建立突变的基因库
• 2.8 PCR 纯化产物的限制性酶切
• 2.9 目的基因的纯化
• 2.10 载体 DNA 的限制性酶切纯化及磷酸化处理
• 2.11 目的基因与载体的连接
• 2.12 感受态细胞的制备
• 2.13 重组质粒的转化
• 2.14 单克隆菌体的筛选和鉴定
• 3. 结果与讨论
• 3.1 重组质粒的构建
• 3.2 突变体酶的分离纯化
• 第二节 高通量筛选立体选择性方法的建立
• 1. 实验材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 2. 实验方法
• 2.1 指示剂的配制
• 2.2 底物纯度的测定
• 2.3 酯酶活力测定
• 2.4 嗜热酯酶突变库的建立
• 2.5 筛选突变体的活性和立体选择性
• 2.6 突变体的立体选择性测定
• 3. 结果与讨论
• 3.1 高通量筛选方法的可行性研究
• 3.2 易错 PCR 突变库的筛选
• 3.3 嗜热酯酶突变体的立体选择性测定
• 3.4 温度对酶立体选择性的影响
• 3.5 突变体结构与立体选择性关系的研究
• 第三节 DNA shuffling 构建嗜热酯酶突变库
• 1. 实验材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 2. 实验方法
• 2.1 重组目的基因的制备
• 2.2 DNase1 的消化
• 2.3 片段自组装
• 2.4 PCR 扩增自组装产物
• 3. 结果与讨论
• 3.1 DNA 重组突变库的建立
• 3.2 筛选 DNA 重组突变库的结果
• 第四节 嗜热酯酶突变体酶学性质的研究
• 1. 实验材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 2. 实验方法
• 2.1 酶的大量提取与纯化
• 2.2 温度对酶活力的影响
• 2.3 pH 对酶活力的影响
• 2.4 金属离子和表面活性剂对酶活力的影响
• 3. 结果与讨论
• 3.1 突变体最适pH 的测定
• 3.2 突变体最适温度的测定
• 3.3 金属离子对酶活的影响
• 参考文献
• 第三章 定点突变提高嗜热酯酶 APE1547 的立体选择性
• 引言
• 第一节 计算机软件合理设计筛选底物
• 1. 实验仪器与材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 底物的合成
• 2.2 底物的纯度测定
• 2.3 计算机模拟
• 2.4 酶催化乙酸2-辛酯的水解反应
• 2.5 转化率和立体选择性测定
• 3. 结果与讨论
• 3.1 底物为苯乙酸2-辛酯的模拟结果
• 3.2 底物为辛酸2-辛酯的模拟结果
• 3.3 底物为乙酸2-辛酯的模拟结果
• 第二节 定点突变提高嗜热酯酶APE1547的立体选择性
• 1. 实验仪器与材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 DpnⅠ酶切
• 2.3 APE1547 突变体菌种的复活及扩大培养
• 2.4 质粒DNA 的小量制备（碱裂解法）
• 2.5 从琼脂糖凝胶中回收 DNA
• 2.6 PCR反应体系
• 2.7 PCR反应条件
• 3. 结果与讨论
• 3.1 定点突变的设计思想
• 3.2 筛选结果及立体选择性的测定
• 3.3 从结构上分析立体选择性变化原因
• 3.4 突变体酶学性质研究
• 参考文献
• 第四章 嗜热酯酶 APE1547 立体选择性与结构关系研究
• 引言
• 1. 实验仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 荧光光谱的测定
• 2.2 突变体基因序列确定
• 2.3 圆二色谱的测定
• 3. 结果与讨论
• 3.1 嗜热酯酶 APE1547 突变体一级结构的变化
• 3.2 突变体T826 的研究
• 3.3 突变体 DT01 与热稳定性的关系
• 3.4 突变体 DT02 突变位点与酶活提高的关系
• 3.5 突变体 DT03 突变位点与立体选择性的关系
• 参考文献
• 第五章 丙酮处理嗜热酯酶 APE1547 及突变体
• 引言
• 1. 实验仪器与材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 2. 实验方法
• 2.1 菌体培养
• 2.2 酶的纯化与制备
• 2.3 丙酮处理冻干酶
• 2.4 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.5 镍柱纯化
• 2.6 酶活力的测定
• 2.7 酶催化的乙酸2-辛酯的水解反应
• 2.8 底物转化率的测定和2-辛醇的光学纯度测定
• 2.9 最适pH 值的测定
• 2.10 最适温度的测定
• 2.11 测定有机溶剂和表面活性剂对酶活力的影响
• 3. 结果与讨论
• 3.1 嗜热酯酶 APE1547 及突变体的表达与纯化
• 3.2 丙酮处理酶活力的变化
• 3.3 丙酮处理酶立体选择性的改变
• 3.4 丙酮处理酶酶学性质的变化
• 参考文献
• 攻读博士期间研究成果
• 论文摘要（中文）
• 论文摘要（英文）
• 致谢
• 作者简历