花生特异表达启动子克隆与抗黄曲霉表达载体构建

论文摘要

花生是世界上重要的经济作物,在热带和亚热带100多个国家广泛种植。由于花生风味独特,营养丰富,花生产品深受人们的喜爱。然而花生黄曲霉污染已经成为一个世界性问题,严重影响了花生的生产、贸易和食品安全。解决花生黄曲霉污染已成为刻不容缓的重大科学问题。随着转基因技术在其他作物上的成功应用,通过转基因技术培育花生抗黄曲霉品种已成为解决花生黄曲霉污染问题最有前景的方法之一。然而,消费者对转基因安全性的关注减缓了转基因技术在蔬菜、水果、粮食作物等重要农作物中的应用。人们对转基因技术在农作物上应用和发展的担忧主要有三个方面：选择性标记基因对环境的潜在危害；外源基因的潜在危害和外源基因的组成型表达对受体作物的影响。为了克服以上安全隐患获得安全的抗黄曲霉转基因花生,本文围绕花生黄曲霉诱导表达启动子克隆、花生组织特异性表达载体构建及遗传转化三个方面做了一系列研究并取得了一定的结果：1.应用侧翼PCR技术,从花生AhOMTl基因上游克隆得到一个1690bp的长片段和一个1103bp的短片段。AhOMTl基因是本实验室从花生果皮中克隆到的一个受黄曲霉诱导大量表达的基因。对从AhOMTl基因上游克隆得到的两条序列进行生物学分析发现两条序列中均包含真菌诱导反应元件、MYB结合位点、防御和抗性反应元件、植物激素响应元件、TATA-box和CAAT-box等,预测该启动子为黄曲霉诱导／真菌诱导-特异启动子。2.分别从花生果皮丰富表达且种仁不表达基因AhLECl和花生果皮特异表达基因AhLACl上游克隆花生果皮丰富表达启动子和果皮特异表达启动子,并分别用这两个启动子替代表达载体pBI121中的CaMV35S启动子,来驱动抗性基因CHI, GLU, TTG2, WRKY, CBF2, RIP, RESS的表达。最终成功构建了13个花生抗黄曲霉组织特异表达载体。3.对花生抗黄曲霉组织特异表达载体pBI121A-B1-RIP通过农杆菌介导法,以花生子叶为外植体进行花生遗传转化。为了提高转基因植株的成活率,本研究应用嫁接技术来替代一般遗传转化方法中生根的环节。最后获得3株PCR技术鉴定为阳性的转基因花生植株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 引言
• 2 黄曲霉及花生黄曲霉污染
• 2.1 黄曲霉和黄曲霉毒素
• 2.2 花生黄曲霉污染
• 3 解决花生黄曲霉污染问题的措施
• 3.1 田问农艺预防
• 3.2 生物防治
• 3.3 传统育种
• 3.4 基因工程
• 4 转基因技术发展和应用的障碍
• 4.1 选择性标记基因的潜在危害
• 4.2 外源基因的组成型表达
• 4.3 外源基因的潜在危害
• 5 植物安全性转基因的研究进展
• 5.1 内源基因的使用
• 5.2 标记基因删除技术
• 5.2.1 共转化法
• 5.2.2 位点特异性重组法
• 5.2.3 转座子法
• 5.2.4 染色体内同源重组法
• 5.2.5 无选择标记基因的转基因技术
• 5.3 特异启动子
• 6 安全抗黄曲霉的转基因花生最新研究进展
• 6.1 花生果种皮特异表达启动子及黄曲霉诱导表达启动子的克隆
• 6.2 黄曲霉抗性相关基因的克隆
• 6.2.1 改变花生果种皮成分或结构的转录因子
• 6.2.2 抗性功能蛋白与抑菌蛋白基因
• 6.2.3 胁迫抗性基因
• 6.3 无选择标记基因的转基因技术
• 7 讨论
• 参考文献
• 第二章 花生黄曲霉诱导表达基因AhOMT1启动子的克隆与鉴定
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 花生基因组DNA提取与文库构建
• 2.3 引物设计与侧翼PCR
• 2.4 生物信息学分析
• 3 结果
• 3.1 DNA提取与文库构建
• 3.2 AhOMT1启动子克隆
• 3.3 AhOMT1启动子序列分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 花生抗黄曲霉组织特异表达载体构建与农杆菌介导的花生遗传转化
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 基因克隆
• 2.2.1 花生基因组DNA提取与启动子克隆
• 2.2.2 抗性相关基因的克隆
• 2.3 表达载体构建
• 2.4 农杆菌介导的花生遗传转化
• 2.4.1 工程菌液的制备
• 2.4.2 外植体的制备
• 2.4.3 花生遗传转化过程
• 2.4.4 伸成不定芽的嫁接
• 2.4.5 PCR鉴定转基因植株
• 3 结果
• 3.1 中间载体pBI121A的构建
• 3.2 启动子克隆与载体构建
• 3.3 基因克隆与载体构建
• 3.3.1 CHI基因克隆与pBI121A-B1-CHI载体构建
• 3.3.2 WRKY基因克隆与pBI121A-B1-WRKY载体构建
• 3.3.3 RIP基因克隆与pBI121A-B1-RIP载体构建
• 3.3.4 GLU基因克隆与pBI121A-B1-GLU载体构建
• 3.3.5 RESS基因克隆与pBI121A-B1-RESS载体构建
• 3.3.6 TTG2基因克隆与pBI121A-B1-TTG2载体构建
• 3.3.7 CBF2基因克隆与pBI121A-B1-CBF2载体构建
• 3.4 果皮特异表达抗黄曲霉载体构建
• 3.5 花生遗传转化
• 3.5.1 遗传转化
• 3.5.2 PCR验证转基因植株
• 4 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢