高效工程菌对水体中类固醇污染物的降解研究

论文摘要

本研究以采自27个不同地区的河水（溪水）及3个商品饮用水作为材料,以高效液相色谱（HPLC）与固相萃取相结合的方法进行环境水体中五种主要类固醇激素（雌酮、雌二醇、雌三醇、胆固醇、睾酮）的测定；同时选用4个地点（福州段）的闽江水作为代表,研究其类固醇污染物含量的周年变化；并应用具有降解多种难降解化合物、能利用类固醇化合物为唯一碳源和能源并将其消耗的睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）,及其改良工程菌株（P8、Ca3）对污染水体中类固醇激素进行降解,以期为工程菌在环境污染生物修复中的应用提供理论依据。主要研究结果如下：1.利用HPLC-SPE方法检测各水样品中类固醇物质主要成分（雌酮、雌二醇、雌三醇、睾酮、胆固醇）的含量结果表明：27不同地点的河水（溪水）及其底泥中均有类固醇化合物残留,经方差分析表明含量差异极显著；商品饮用水：市售纯净水、矿泉水中均未检测出该类物质。2.福州段闽江及城市内河选取四个地点检测水中类固醇物质主要成分（雌酮、雌二醇、雌三醇、睾酮）含量的动态测定,结果表明：上述各物质含量变化趋势并不完全一致,各雌情化物质中对环境最具潜在影响的雌二醇在1月、11月的含量相对较高,而5月、8月含量相对较低,经方差分析显示各月份含量存在显著差异；类固醇物质主要成分（雌酮、雌二醇、雌三醇、睾酮）的总含量在5月份最低,经方差分析显示与其他3个月份存在显著差异。3.利用野生型睾丸酮丛毛单胞菌（C.t.）及基因改造菌株P8、Ca3,对水体中残留的类固醇化合物及其主要成分（雌酮、雌二醇、雌三醇、睾酮）的降解试验结果表明：不同采集水样、菌株、月份各因子水平上都存在显著差异。基因改造菌株P8、Ca3对类固醇化合物的降解能力优于野生型菌株C.t.；不同地点水体中,P8菌株在48±1h后对类固醇化合物的降解率比C.t.高出1.13-1.33倍,可以达到68.32%～70.22%。降解过程中接种的各工程细菌（P8、Ca3）密度呈指数衰减而后趋于稳定,之后随着时间的推移细菌的活细胞数量越来越少,最终可达10-100 cfu/L,各菌株活细胞数量比较为：C.t>P8>Ca3,即工程菌最终残留密度均低于野生型菌株C.t.。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 概述
• 1.1 水环境污染
• 1.1.1 水污染的含义及其特征
• 1.1.2 水环境雌激素及其危害
• 1.1.3 水体中类固醇化合物污染
• 1.2 水环境中类固醇化合物的检测
• 1.2.1 水样品的前处理方法
• 1.2.1.1 溶剂萃取
• 1.2.1.2 固相萃取
• 1.2.1.3 超临界萃取
• 1.2.2 类固醇化合物检测方法
• 1.2.2.1 化学分析方法
• 1.2.2.2 生物方法
• 1.3 环境污染的生物修复
• 1.3.1 生物修复的种类及国内外研究现状
• 1.3.2 工程菌在生物修复中的应用
• 1.3.2.1 基因工程菌的国内外研究现状
• 1.3.2.2 基因工程菌在生物修复中存在的问题
• 1.4 微生物对类固醇化合物的转化
• 1.4.1 类固醇化合物的结构与种类
• 1.4.2 微生物对类固醇化合物的降解与转化
• 1.5 睾丸酮丛毛单胞菌的研究现状及在生物修复中的应用
• 1.6 本课题的研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 样品
• 2.1.1.1 供试水样品的来源
• 2.1.1.2 供试底泥样品的来源
• 2.1.1.3 用于周年含量变化检测的水样
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 高效液相色谱-固相萃取法对水体中痕量类固醇化合物的检测
• 2.2.1.1 样品的固相萃取
• 2.2.1.2 底泥的甲醇超声萃取
• 2.2.1.3 五种类固醇化合物的高效液相测定方法
• 2.2.1.4 回收率和精密度试验
• 2.2.1.5. 萃取样品体积对回收率的影响
• 2.2.2 取样
• 2.2.2.1 不同地区河水（溪水）中类固醇化合物含量分析的样品
• 2.2.2.2 河水（溪水）类固醇化合物含量周年变化分析的样品
• 2.2.3 采集水样品的预处理方法
• 2.2.3.1 水样品的预处理
• 2.2.3.2 底泥样品的预处理
• 2.2.4 工程菌对水体中类固醇化合物的降解能力的测定
• 2.2.4.1 细菌培养
• 2.2.4.2 细菌悬浮液的制备
• 2.2.4.3 工程菌投放量的优化
• 2.2.4.4 工程菌降解时间的确定
• 2.2.4.5 水体中类固醇污染物降解试验设计
• 2.2.5 降解过程工程菌菌种密度测定试验
• 2.3 数据分析方法
• 3 结果与分析
• 3.1 不同地区河水中主要类固醇化合物含量测定
• 3.1.1 不同地区河水中主要类固醇化合物含量分析
• 3.1.2 不同地区河水中雌酮含量差异分析
• 3.1.3 不同地区河水中雌二醇含量差异分析
• 3.1.4 不同地区河水中雌三醇含量差异分析
• 3.1.5 不同地区河水中睾酮含量差异分析
• 3.1.6 不同地区河水中类固醇化合物总含量差异分析
• 3.1.7 闽江福州段底泥中类固醇物质的含量
• 3.2 闽江福州段及城市内河河水中类固醇化合物含量的周年变化分析
• 3.2.1 不同月份河水中四种类固醇物质含量分析
• 3.2.2 闽江福州段河水中雌酮的含量季节变化分析
• 3.2.3 闽江福州段河水中雌二醇的含量季节变化分析
• 3.2.4 闽江福州段河水中雌三醇的含量季节变化分析
• 3.2.5 闽江福州段河水中睾酮的含量季节变化分析
• 3.2.6 闽江福州段河水中类固醇物质的总含量季节变化分析
• 3.3 工程菌对水体中类固醇化合物的降解能力测定
• 3.3.1 适宜细菌投加量的确定
• 3.3.2 降解时间的确定
• 3.3.3 工程菌对水体中类固醇物质的降解
• 3.3.3.1 工程菌对水体中各种类固醇物质降解的差异分析
• 3.3.3.2 工程菌对水体中雌酮的降解分析
• 3.3.3.3 工程菌对水体中雌二醇的降解分析
• 3.3.3.4 工程菌对水体中雌三醇的降解分析
• 3.3.3.5 工程菌对水体中睾酮的降解分析
• 3.4 降解过程工程菌种群的数量变化
• 4 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 样品的前处理
• 4.1.2 流域水量时空差异对河水（溪水）中类固醇化合物含量的影响
• 4.1.3 睾丸酮丛毛单胞菌不同基因改造型的降解能力
• 4.1.4 工程菌对水体中类固醇化合物降解的影响因素
• 4.1.4.1 生物因素对睾丸酮丛毛单胞菌的影响
• 4.1.4.2 非生物因素对睾丸酮丛毛单胞菌的影响
• 4.1.5 工程菌株在水环境中的适应能力
• 4.2 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ
• 致谢