热应激对小鼠附植前早期胚胎发育影响的研究

论文题目: 热应激对小鼠附植前早期胚胎发育影响的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 临床兽医学

作者: 杜立银

导师: 田文儒

关键词: 昆明白鼠,热应激,胚胎发育,诱导表达

文献来源: 东北农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 选择昆明白鼠为受试动物, 以注射人绒毛膜促性腺激素( human chorionic gonadotropin,hCG)后的胚胎发育阶段为标准(注射hCG 完毕为0h),分别在早期合子(注射hCG 后16～20h)、晚期合子(第一次分裂初期,注射hCG 后28～32h)、2 细胞中期(注射hCG 后40～44h)对母体和体外发育胚胎实施了温和热应激(37℃4h)、中度热应激(39℃4h)、重度热应激(41℃4h)和极度热应激(43℃4h)。运用胚胎形态学观察法,研究比较了热应激对体内和体外发育的附植前早期1～2 细胞小鼠胚胎的负效应;运用免疫荧光细胞化学的方法,研究比较了热应激对体内和体外发育胚胎内热休克蛋白70(HSP70)的诱导表达,确定胚胎热耐受的发育获得与胚胎阶段的关系,从而在细胞水平和分子水平上进一步验证和揭示了胚胎热耐受机理。最后,运用免疫荧光组织化学的方法,检验了卵巢组织在热应激后0～28h 恢复期内的HSP70 诱导表达,以拓展对HSP70 表达的组织特异性的认识(热应激温度同胚胎)。试验结果如下: 1.母体热应激对体内1～2 细胞胚胎的后继发育能力具有显著的影响: 母体热应激后,早期合子、晚期合子和2 细胞中期胚胎发育到4 细胞的百分率降低,胚胎阶段越早、温度越高差异越显著,并且温度水平上的负效应大于胚胎细胞阶段的负效应。在温度水平上:与37℃组相比,39℃组差异不显著(p>0.05)、41℃和43℃差异极显著(p<0.01,p<0.01);与39℃相比,41℃(p<0.05)和43℃(p<0.01)均有显著差异,但两组之间无差异(p>0.05)。在胚胎发育阶段上:早期与晚期合子的热应激差异不显著(p>0.05),但早期合子与2 细胞中期的差异显著(p<0.05)。这说明胚胎在发育过程中抗热应激能力逐渐增强。晚期合子阶段的37℃温和母体热应激,非但没有诱导胚胎的热耐受,反而加剧了再次高温对2 细胞中期胚胎发育的阻抑程度(p<0.05)。这说明,合子尚不具备获得热耐受的能力。正常体外发育条件下,来自39℃热应激鼠的4 细胞胚胎,在37℃正常培养条件下,注射hCG 后16～20h、28～32h、40～44h 组和对照组的发育率(57.9%,58.8%,67.6%,59.1%)相比,试验组依次升高,前两组均低于对照组,而40～44h 组高于对照组,且与16～20h 组差异显著(p<0.05),其他组间无显著差异。在体外43℃4h 热应激条件下,注射hCG 后16～20h、28～32h、40～44h 组的百分率渐次升高(0.8%,2.8%,7.0%),而且三者间差异显著(p<0.05,p<0.01,p<0.05);同时,试验组中的16～20h 组和28～32h 组均显著低于对照组(p<0.01,p<0.05),而40～44h 组则高于对照组(5.0%)。可见,早期合子和晚期合子阶段的39℃母体热应激降低了4 细胞胚发育到囊胚的能力,而对应的2 细胞中期胚胎却略有提高。这说明,母体热应激的负效应可在胚胎体外发育过程继续发挥作用,并与母体热应激的胚胎阶段密切相关。2.热应激对体外发育的1～2 细胞胚发育具有显著的负效应:在合子早期、晚期合子和2细胞中期热应激处理体外发育胚胎后,从发育至囊胚的百分率看(10.5%,13.1%,20.0%),胚胎抗应激能力显著提高,温度升高则显著降低(33.6%,17.6%,5.6%,1.7%)。这说明,胚胎在发育过程中对热应激的抵抗力显著提高(p<0.05 或p<0.01)。3.热应激对体外和体内1～2 细胞胚胎发育具有负效应差异:体外发育的胚胎分别在合

论文目录:

摘要

ABSTRACT

1 引言

1.1 胚胎发育

1.1.1 卵子发生与成熟

1.1.2 精子发生与受精

1.1.3 体内胚胎发育

1.1.4 体外胚胎发育

1.1.5 胚胎基因组的表达

1.2 热应激与热休克蛋白70 的表达

1.2.1 应激研究概述

1.2.2 热应激(热休克)反应的研究历史

1.2.3 热休克蛋白的分类

1.2.4 热休克蛋白70的表达特性与基因调控

1.3 热休克蛋白70的生物学功能

1.3.1 提高细胞热耐受性

1.3.2 分子伴侣功能

1.3.3 抗细胞凋亡功能

1.3.4 抗细胞氧化功能

1.3.5 其他功能

1.4 热休克蛋白70 与动物生殖

1.4.1 热休克蛋白70 与细胞周期调控

1.4.2 热休克蛋白70 与卵母细胞发育能力

1.4.3 热休克蛋白70 与精子生成和受精过程

1.4.4 热休克蛋白70 与胚胎发育

1.5 研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验方案的总体设计

2.1.1 热应激强度的确立

2.1.2 实施热应激的胚胎发育阶段的确立

2.1.3 母体热应激对体内1～2 细胞胚胎后继发育能力的影响

2.1.4 热应激对体外1～2 细胞胚胎后继发育能力的影响

2.1.5 热应激对附植前早期胚胎细胞内HSP70 表达的诱导

2.1.6 热应激对卵巢组织HSP70 表达的诱导

2.2 主要试验仪器与设备

2.3 主要试剂

2.4 常用小型器械与消耗品

2.5 试验动物

2.6 材料采集与处理方法

2.6.1 试验样品采集与前处理

2.6.2 胚胎体内发育试验

2.6.3 胚胎体外发育试验

2.6.4 胚胎HSP70 的免疫荧光细胞化学检验

2.6.5 卵巢组织中HSP70 的免疫荧光组织化学检验

2.7 试验数据的分析与统计

3 结果

3.1 母体热应激对体内1～2 细胞胚胎发育能力的影响

3.1.1 不同温度热应激对早期合子后继发育能力的影响

3.1.2 不同温度热应激对晚期(第一次卵裂初期)合子后继发育能力的影响

3.1.3 相同温度热应激对早期和晚期合子后继发育能力的影响

3.1.4 不同温度热应激对2 细胞中期胚胎后继发育能力的影响

3.1.5 不同温度的母体热激应对不同阶段胚胎后继发育能力的影响

3.1.6 不同胚胎阶段的二次母体热应激对胚胎后继发育能力的影响

3.1.7 母体热应激对4 细胞胚胎在体外热应激条件下发育能力的影响

3.2 热应激对1～2 细胞阶段胚胎体外后继发育能力的影响

3.3 热应激对附植前早期胚胎细胞内HSP70 表达的诱导

3.4 卵巢组织HSP70 的免疫荧光组织化学检验

4 讨论

4.1 母体热应激对1～2 细胞后继发育能力的影响

4.1.1 母体热应激对合子后继发育能力的影响

4.1.2 母体热应激对2 细胞中期胚胎后继发育能力的影响

4.1.3 二次母体热应激对胚胎发育能力的影响

4.1.4 母体热应激对4 细胞胚胎在体外热应激条件下后继发育能力的影响

4.2 体外热应激对1～2 细胞胚胎后继发育能力的影响

4.3 热应激诱导胚胎细胞HSP70 的表达

4.3.1 免疫荧光细胞化学的基本原理

4.3.2 热应激诱导胚胎细胞HSP70 的表达

4.4 卵巢组织HSP70 的诱导表达模式

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文

发布时间: 2005-10-31

参考文献

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