农杆菌介导的双价抗虫基因转入大豆的研究

论文摘要

大豆生育期间受害虫侵害严重,常给大豆生产造成巨大损失。大量喷施化学杀虫剂,不仅会增强害虫的抗药性,使益虫及其它生态区系遭受破坏,而且严重污染环境,提高生产成本,破坏生态平衡。常规育种及栽培技术由于育种年限长,遗传资源有限,抗虫机制不甚明了,以及害虫新生物型的发展导致抗性不稳定等原因已有一定的局限性,收效不大。因此利用植物基因工程技术使大豆达到抗虫的目的受到密切关注。本文利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将含有豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)和人工合成的GFM CryIA B.t杀虫基因的双价抗虫基因植物表达载体pGBI121S 4ABC用于栽培大豆品种“吉林20号”、“吉林27号”的转化。未成熟子叶诱导的体细胞胚经与农杆菌共培养,在筛选培养基上获得抗性胚体并萌发成可育转化植株。经PCR鉴定,GUS酶活性检测证实,外源抗虫基因存在于再生植株的细胞中。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1. 我国大豆生产的基本概况
• 2. 转基因大豆的生产概况
• 3. 植物虫害的基本概况及应对策略简介
• 4. 抗虫基因的抗虫原理及其应用现状
• 4.1 抗虫基因的分类
• 4.2 Bt 基因的抗虫原理
• 4.3 Bt 杀虫蛋白的基本分子结构
• 4.4 Bt 杀虫蛋白基因定位及其表达和修饰
• 4.4.1 Bt 杀虫蛋白基因定位
• 4.4.2 Bt 基因的表达和修饰
• 4.4.3 Bt 杀虫基因的改造和载体的构建
• 4.5 第二代抗虫基因
• 5. 转双价抗虫基因植物的研究
• 5.1 转双价抗虫基因植物的提出
• 5.2 获得转双价抗虫基因植物的研究现状
• 6. 大豆农杆菌介导法发展概况
• 7. 农杆菌介导的遗传转化机理
• 8. 本研究的意义
• 材料和方法
• 1. 材料
• 1.1 试材
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 试剂
• 1.4 仪器设备
• 2. 方法
• 2.1 培养基的配制
• 2.1.1 大肠杆菌培养基
• 2.1.2 农杆菌培养基
• 2.1.3 大豆转化培养基
• 2.1.3.1 基本培养基 B5、MS
• 2.1.3.2 生长培养基 GM
• 卫1'>2.1.3.3 共培养培养基 S、M_卫1
• 2.1.3.4 筛选诱芽培养基 MSE
• 2.1.3.5 生根培养基
• 2.1.4 大豆幼胚培养基
• 2.2 大豆的转化流程
• 2.2.1 菌液的制备
• 2.2.2 灭菌过程
• 2.2.3 接种大豆
• 2.2.4 转化过程
• 2.2.5 筛选诱芽培养
• 2.2.6 根的诱导
• 2.2.7 移栽
• 2.3 大豆幼胚的组织培养流程
• 2.4 卡那霉素筛选愈伤组织的梯度试验方法
• 2.5 转基因植株的检测
• 2.5.1 GUS 组织化学分析
• 2.5.2 PCR检测
• 2.5.2.1 DNA 的提取与纯化
• 2.5.2.2 引物序列
• 2.5.2.3 PCR 反应体系
• 2.5.2.4 PCR 反应程序
• 2.5.2.5 电泳检测
• 结果与分析
• 1.大豆幼胚组织培养再生苗的获得
• 2. 卡那霉素筛选愈伤组织的梯度实验
• 3. 转基因大豆的获得
• 4. 转基因大豆的检测
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢