乳酸菌食品级基因表达载体的构建

论文摘要

乳酸菌（Lactic bacteria）大多是益生菌，食品级的乳酸菌工程菌本身及其表达产物可直接应用于食品工业、医药工业和保健业等领域。乳酸菌食品级表达载体的构建，对一些有益蛋白的表达具有诱人的发展前景。本课题从具nisin抗性的乳酸菌中扩增nisin抗性基因（NSR）作为食品级基因表达载体的选择标记，代替乳酸菌表达载体pMG36e中的红霉素抗性标记，构建乳酸菌食品级基因表达载体pMG36n，并电转化乳酸菌。通过含nisin和溴甲酚紫的培养基，从鲜牛奶中初步筛选得到5株具nisin抗性的菌株，命名为N1、N2、N3、N4、N5；同时，对实验室保藏的乳酸菌进行筛选，其中乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactis subsp. cremons）和M2（嗜热链球菌，Streptococcusthermophilus）不具有nisin抗性，且不含质粒，因此，构建以nisin抗性基因作为选择标记的载体后，两株菌可以作为受体菌。分别以N1、N2、N3、N4、N5的基因组和质粒为模板扩增NSR基因保守序列，只有以N1、N2、N5的质粒为模板时，扩增出约400bp的片段，说明NSR基因位于质粒上，而不是基因组中。对N1、N2、N5进行生理生化和16S rDNA鉴定，结果表明三者均为乳酸乳球菌乳亚种。采用抑菌圈法研究N1、N2、N5的发酵液，结果表明3株菌的发酵液对金黄色葡萄球菌均无抑制作用，即3株菌本身都不产生nisin。将3株菌的16SrDNA测序结果提交GenBank，序列号分别为HQ647114、HQ647115、HQ647116。以N1、N2、N5质粒为模板，扩增包含起始密码子和转录终止子的NSR全长序列，得到约1000bp左右的片段。将N1的NSR产物连接到pMD19-T载体进行测序，测序结果提交GenBank，序列号为HQ701130；通过生物信息学分析得知，N1菌株NSR基因全长1014bp，含A碱基383个，C碱基149个，G碱基175个，T碱基307个；第4960位是开放阅读框（ORF），可编码318个氨基酸；在第12个氨基酸左右有一个明显的疏水区；第1030个氨基酸间可能有一个跨膜结构。将N1菌株的NSR基因插入载体pMG36e的多克隆酶切位点，CaCl2法转化大肠杆菌DH5α，NSR基因能使宿主菌具有nisin抗性，可以作为筛选标记。采用PCR法扩增载体pMG36e中除红霉素抗性基因以外的序列——pMG36e-片段；将pMG36e-片段和N1的NSR全长基因进行连接，得到重组食品级载体pMG36n；采用电转化法在电压2000V、电容25μF、电击常数5ms的条件下将pMG36n成功转入乳酸乳球菌乳脂亚种，转化菌株可在含nisin的选择性培养基上生长。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 食品级表达载体
• 1.1.1 糖类利用选择性标记
• 1.1.2 营养缺陷型互补标记
• 1.1.3 乳酸菌抗性筛选标记
• 1.1.4 其他食品级选择标记
• 1.2 食品级宿主菌
• 1.2.1 乳球菌
• 1.2.2 乳杆菌
• 1.2.3 双歧杆菌
• 1.3 食品级诱导物
• 1.4 乳酸菌的食品级表达系统
• 1.4.1 Nisin 诱导的食品级表达系统
• 1.4.2 糖诱导的食品级表达系统
• 1.4.3 嘌呤诱导的食品级表达系统
• 1.4.4 温控食品级表达系统
• 1.4.5 pH 值诱导食品级表达系统
• 1.5 本课题研究的目的和意义
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 研究意义
• 1.6 研究内容
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 工具酶
• 2.1.4 实验常用溶液
• 2.1.5 实验仪器设备
• 2.1.6 分析工具
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 培养基的制备
• 2.2.2 nisin（乳链菌肽）抗性菌株的筛选
• 2.2.3 nisin 抗性基因（NSR）保守序列的克隆
• 2.2.4 nisin（乳链菌肽）抗性菌株的鉴定
• 2.2.5 nisin（乳链菌肽）抗性菌株发酵液的研究
• 2.2.6 nisin 抗性基因（NSR）全长序列的克隆及测序
• 2.2.7 NSR 全长序列的生物信息学分析
• 2.2.8 NSR 基因在大肠杆菌中的表达
• 2.2.9 pMG36n 载体的构建
• 2.2.10 pMG36n 质粒的电转化
• 第三章 结果与分析
• 3.1 nisin 抗性菌株的筛选
• 3.1.1 nisin 原液活性的验证
• 3.1.2 实验室保藏菌种 nisin 抗性的鉴定
• 3.1.3 鲜奶中 nisin 抗性菌的筛选
• 3.2 nisin 抗性基因（NSR）保守序列的克隆
• 3.2.1 nisin 抗性菌质粒的提取
• 3.2.2 nisin 抗性菌基因组的提取
• 3.2.3 nisin 抗性基因（NSR）保守序列的扩增
• 3.3 nisin 抗性菌株的鉴定
• 3.3.1 nisin 抗性菌株的生理生化鉴定
• 3.3.2 nisin 抗性菌株的 16S rDNA 鉴定
• 3.4 nisin 抗性菌株抗性分子机制的初步判定
• 3.5 nisin 抗性基因（NSR）全长序列的克隆及生物信息学分析
• 3.5.1 NSR 全长序列的扩增
• 3.5.2 NSR 全长序列切胶纯化
• 3.5.3 重组质粒的检测
• 3.5.4 重组质粒的鉴定
• 3.5.5 NSR 全长基因测序结果
• 3.5.6 NSR 序列的生物信息学分析
• 3.6 NSR 基因在大肠杆菌中的表达
• 3.6.1 pMG36e 质粒的提取及含酶切位点的 NSR 基因的扩增
• 3.6.2 NSR 基因和 pMG36e 质粒双酶切
• 3.6.3 NSR 和 pMG36e 的连接以及重组质粒 pMG36e-NSR 的 PCR 鉴定
• 3.7 pMG36n 载体的构建及电转化
• 3.7.1 含相同酶切位点的 NSR 基因（NE）和 pMG36e-片段的扩增
• 3.7.2 NE 片段和 pMG36e-片段的双酶切
• 3.7.3 NSR 和 pMG36e-的连接以及重组质粒 pMG36n 的 PCR 鉴定
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 个人简历
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文