醋酸铅对大鼠大脑皮质神经细胞毒性损伤及NAC的保护效应研究

论文摘要

本研究探讨了铅对中枢神经系统的毒性机理,建立了体外培养新生24h内SD大鼠大脑皮质神经细胞的铅损伤模型。采用尼氏染色法、荧光染色法、MTT法及脂质过氧化相关酶试剂盒测定等方法,利用倒置相差显微镜、环境扫描电子显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪等观察并测定了醋酸铅对神经细胞的形态、存活率、凋亡率、脂质过氧化相关酶的影响,并采用乙酰半胱氨酸（N-Acetyl Cyst- eine,NAC）对醋酸铅进行干预,评价其对神经细胞的保护效果。实验结果显示:（1）体外原代培养的神经细胞在第6d形态最佳、活力最强,可用于进一步试验研究;（2）不同浓度（50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L）醋酸铅对培养的神经细胞分别作用3h、6h、12h、24h,测定各试验组细胞形态。结果显示,染铅12h以上,细胞形态较对照组有显著差异（P﹤0.05）,且随铅浓度的递增和作用时间的延长,抑制作用增强;（3）醋酸铅作用培养的神经细胞12h,各染铅组细胞存活率较对照组显著降低（P﹤0.05）[0],且随铅浓度的增加和作用时间的延长,存活率递减。（4）醋酸铅作用培养的神经细胞12h,Hoechst 33258染色5min,荧光显微镜观察结果显示,细胞核皱缩、呈新月形,染色质致密浓染,甚至核碎裂。流式细胞仪检测结果显示,随铅浓度的增高,细胞凋亡率较对照组逐渐上升;（5）醋酸铅作用培养的神经细胞12h, GSH-PX、SOD、TChE活性较对照组显著降低（P﹤0.05）,而CAT和MDA则显著升高（P﹤0.05）;（6）NAC保护组与染铅组比较:各保护组细胞存活率有所升高;细胞凋亡率有所下降;GSH-PX、SOD、TChE、CAT活性升高;MDA含量下降。结论:（1）醋酸铅可抑制细胞分化,影响神经细胞形态,减少细胞间连接,该作用具有剂量—时间效应。（2）铅诱导神经细胞凋亡是铅引起细胞损伤的机制之一,表现为神经细胞存活率下降,细胞凋亡数增多,该作用与染铅剂量有明显的剂量—时间效应;（3）铅的神经毒性与细胞的脂质过氧化有关,表现为神经细胞的脂质过氧化相关酶的活性变化,且该变化与染铅剂量存在剂量—时间效应;（4）NAC具有拮抗铅毒性的作用,表现为NAC对铅引起的神经细胞存活率下降、凋亡率上升具有一定的抑制作用,同时在一定程度上可缓解铅引起的氧化损伤。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词
• 第一部分 文献综述
• 综述一 铅的神经毒性机制研究进展
• 综述二 乙酰半胱氨酸对重金属的拮抗作用及机理研究进展
• 第二部分 研究内容
• 前言
• 实验一新生大鼠大脑皮质神经细胞原代培养方法的建立及活性鉴定
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 溶液配制
• 2.2 培养板包被处理
• 2.3 大鼠大脑皮质神经细胞的分离培养
• 2.4 大鼠大脑皮质神经细胞的形态学观察
• 2.5 大脑皮质神经细胞的纯度鉴定-Nissl’s 染色
• 2.6 大脑皮质神经细胞的活性鉴定-MTT 法
• 3 结果与分析
• 3.1 神经细胞的形态学观察
• 3.2 Nissl’s 染色结果
• 3.3 MTT 法测定神经细胞活性
• 4 讨论
• 5 小结
• 实验二铅对大脑皮质神经细胞的毒性效应和形态学损伤
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 不同浓度醋酸铅溶液的配制
• 2.2 大脑皮质神经细胞的铅损伤模型的建立
• 2.3 醋酸铅对大脑皮质神经细胞的形态学影响
• 2.4 MTT 比色法测定神经细胞存活率
• 2.5 铅对大脑皮质神经细胞凋亡的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 铅对大脑皮质神经细胞形态学的影响
• 3.2 铅对大脑皮质神经细胞存活率的影响
• 3.3 铅对神经细胞凋亡的形态学影响
• 3.4 铅对神经细胞凋亡率的影响
• 4 讨论
• 5 小结
• 实验三低剂量铅对大脑皮质神经细胞的脂质过氧化损伤
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 不同浓度醋酸铅溶液的配制
• 2.2 大脑皮质神经细胞的培养及染毒处理
• 2.3 谷胱甘肽过氧化物酶的活力测定
• 2.4 超氧化物歧化酶的活力测定
• 2.5 乙酰胆碱酯酶的活力测定
• 2.6 过氧化氢酶的活力测定
• 2.7 丙二醛含量的测定
• 2.8 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 铅对 GSH-Px、SOD、TChE、CAT 及 MDA 的影响
• 4 讨论
• 5 小结
• 实验四 NAC 拮抗铅对大脑皮质神经细胞损伤的研究
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 主要溶液的配制
• 2.2 大脑皮质神经细胞的培养
• 2.3 染铅组与 NAC 拮抗组对大脑皮质神经细胞存活率的影响
• 2.4 醋酸铅组与 NAC拮抗组对大脑皮质神经细胞凋亡率的影响－流式细胞仪检测
• 2.5 醋酸铅组与NAC拮抗组对细胞内GSH-Px S、OD、TChE、CAT活力及MDA含量的影响
• 3 结果
• 3.1 NAC 对大脑皮质神经细胞存活率的影响
• 3.2 流式细胞仪检测结果
• 3.3 醋酸铅及 NAC 拮抗组对神经细胞内 GSH-Px、SOD、TChE、CAT 活力及 MDA 含量的影响
• 4 讨论
• 5 小结
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介
• 攻读硕士学位期间发表文章