论文题目: 牙鲆抗病毒及免疫相关基因的克隆鉴定及表达分析
论文类型: 博士论文
论文专业: 水生生物学
作者: 杜昌升
导师: 张奇亚
关键词: 牙鲆,牙鲆囊胚培养细胞,差减,文库,抗病毒免疫相关基因,基因克隆,差减杂交,非特异性免疫因子,趋化因子,弹状病毒,细胞凋亡
文献来源: 中国科学院研究生院（水生生物研究所）
发表年度: 2005
论文摘要: 牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一个优良的高效海水养殖品种。目前在国内被广泛养殖,给养殖业创造了良好的经济效益。但是目前的主要养殖方式是室内工厂化,与海上的网箱养殖相比,养殖密度大,水质容易恶化,称为各种疾病的诱因,而且牙鲆具有水底集群的习性,使得疾病传染加剧,虽然利用一些药物取得了一定的防治效果,但是长期的施药不仅会导致水体的污染,也会造成诸多耐药性病原体的产生,为进一步的防治工作变得更为复杂。因此进行牙鲆相关的鱼类免疫学研究是必要和必须的。本文的研究内容和结果主要包括以下几个方面: 首先,探索了SMRV 病毒和鱼类培养细胞的相互作用,结果发现,SMRV 病毒感染的CLC 细胞死亡途径主要是细胞凋亡,凋亡的发生基本上不影响子代病毒粒子的复制,而病毒的复制对细胞凋亡的发生则是必须的。其次,以灭活大鳞鲆弹状病毒诱导的牙鲆(Paralichthys olivaceus)传代细胞作为检测子(tester),正常对照细胞作为驱赶子(driver),分别提取mRNA,逆转录合成双链cDNA。经两轮差减杂交,两轮抑制性PCR 扩增后,取正向差减的PCR 产物与T 载体连接,构建抑制差减cDNA 文库,随机挑取7400 余个克隆,对其中4200 多个克隆进行PCR 扩增鉴定,发现近4000 个克隆中均含有插入片段,大小在250-1000bps 之间,进一步对含有插入片段的近4000 个克隆进行了斑点杂交筛选,得到近668 个可能含有抗病毒或与免疫相关的阳性克隆。初步的结果表明所建立的差减cDNA 文库适合进一步克隆鱼类抗病毒相关新基因。第三,构建SMART-cDNA 文库并结合RACE 技术成功克隆到了cystein proteinase, decorin, NDPK, RACK, chemokine 等重要的免疫相关基因,这些基因在牙鲆中都是首次被克隆鉴别,利用对它们的RT-PCR 分析表明,不同的基因在细胞及组织上具有不同的时空分布。最后,对decorin 基因进行了进一步的重组原核表达载体的构建、原核表达、蛋白纯化、抗体制备,对肝、脾、头肾、后肾、皮肤、心、肌肉、脑、肠、鳃、卵巢、精巢等组织中的decorin 表达蛋白进行的western blot 分析表明在检测
论文目录:
第一章 文献综述
1. 前言
2. 鱼类免疫因子的分子生物学研究进展
2.1 趋化因子
2.2 细胞因子
2.3 急性时相反应蛋白(acute phase proteins, APPs)
2.4 补体系统(complement system)
2.5 天然抗体(Natural antibodies)
2.6 Toll 信号通路介导的非特性免疫(参考文献待定)
2.7 自身识别相关受体
3. 本研究的目的、意义及实验设计
第二章 大菱鲆弹状病毒诱导鱼类培养细胞的凋亡
1. 前言
2. 材料与方法
2.1 细胞、细胞培养基及细胞培养
2.2 病毒、病毒感染及病毒滴度测定
2.3 SMRV 病毒的紫外线灭活
2.4 培养细胞的荧光染色
2.5 电子显微镜制样及观察
2.6 细胞核酸的提取和琼脂糖凝胶电泳
2.7 流式细胞术
3 结果
3.1 感染前后CLC 细胞发生显著的形态学变化
3.2 病毒感染的CLC 细胞中出现典型的 DNA 梯形带
3.3 流式细胞术显示了感染SMRV 的CLC 细胞中凋亡的存在
3.4 SMRV 病毒感染不同时间的 CLC 细胞中凋亡细胞含量与及病毒滴度的变化关系
3.5 灭活的SMRV 病毒不能诱导CLC 细胞发生凋亡
4 讨论
第三章 灭活病毒诱导牙鲆传代细胞差减cDNA 文库的构建及评价
1. 前言
2 材料与方法
2.1 细胞与病毒
2.2 病毒灭活及细胞诱导处理
2.3 牙鲆细胞总RNA 提取
2.4 诱导组和对照组mRNA 的纯化
2.5 差减cDNA 文库的建立
2.6 Tester cDNA 的接头连接效率和抗病毒基因差减文库的差减效率的检测
2.7 差减cDNA 质粒文库的构建
3 结果与分析
2.1 牙鲆细胞总RNA 及mRNA 质量评价
2.2 双链cDNA 合成和 RsaⅠ酶切效率
2.3 两次抑止性PCR 产物
2.4 双链cDNA 接头连接效率
2.5 差减效率
4 讨论
第四章 差减cDNA 文库的筛选及ESTs 分析鉴定
1. 前言
2 材料与方法
2.1 差减cDNA 质粒文库克隆的PCR 筛选筛选
2.2 斑点杂交筛选
2.3 序列测定、序列分析及功能注释
3 结果与分析
3.1 差减cDNA 文库容量及文库中插入片段大小
3.2 斑点杂交
3.3 差减cDNA 片断的序列测定和分析
4 讨论
第五章 抗病毒及免疫相关基因全长cDNA 的克隆及序列分析
第一节 牙鲆CC 型趋化因子的克隆鉴定和序列分析
1. 前言
2. 材料和方法
2.1 SMART cDNA 的合成
2.2 质粒文库的构建及序列测定
2.3 序列同源性、多序列对位分析及遗传进化树的绘制
3. 实验结果
3.1 牙鲆趋化因子FE-CCL19 cDNA 全序列及其推导的氨基酸序列
3.2 氨基酸序列分析
3.3 多序列对比及遗传进化树的绘制
4. 讨论
第二节 核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinases,NDPK)克隆鉴定和表达分析
1. 前言
2. 材料方法
2.1 RACE-PCR 扩增FE-NDPK 基因全长cDNA 序列
2.2 序列同源性、多序列对位分析及遗传进化树的绘制
2.3 组织RNA 的提取以及利用RT-PCR 进行 FE-NDPK 组织特异性表达分析
3. 结果与分析
2.1 cDNA 全序列及其推导的氨基酸序列
2.2 氨基酸序列分析
2.3 多序列对比及遗传进化树的绘制
2.4 正常牙鲆各种组织中 FE-NDPK mRNA 转录水平的定量分析
4. 讨论
第三节 活化型蛋白激酶 C 受体克隆鉴定和表达分析
1. 前言
2. 材料和方法
2.1 RACE-PCR 扩增FE-RACK1 基因全长cDNA 序列
2.2 序列同源性、多序列对位分析及遗传进化树的绘制
2.3 组织RNA 的提取和 RT-PCR 进行表达分析
3 结果与讨论
3.1 cDNA 全序列及其推导的氨基酸序列
3.2 蛋白序列分析
3.3 多序列对比及遗传进化树的绘制
3.4 RACK 基因在牙鲆不同组织中的分布差异
第四节 一个新的半胱氨酸蛋白酶基因的cDNA 克隆和序列分析
1. 前言
2. 材料和方法
2.1 RACE-PCR 扩增FE-26/29kD 基因全长cDNA 序列
2.2 序列同源性、多序列对位分析及遗传进化树的绘制
2.3 组织RNA 的提取以及利用RT-PCR 进行 FE-26
3. 实验结果
3.1 FE-26/29kD 基因全长cDNA 序列及推导的氨基酸序列
3.2 氨基酸序列分析
3.3 多序列对比及遗传进化树的绘制
3.4 正常牙鲆各种组织中 FE-26/29kD 基因mRNA 转录水平的定量分析
4. 讨论
第五节 decorin 基因全长的cDNA 的克隆、序列分析、组织定位以及其在细菌和牙鲆细胞中的重组表达
1. 前言
2. 材料和方法
2.1 RACE-PCR 扩增FE-DCN 基因全长cDNA 序列
2.2 序列同源性、多序列对位分析及遗传进化树的绘制
2.3 组织RNA 的提取以及利用RT-PCR 进行 FE-NDPK 组织特异性表达分析
2.4 细胞RNA 的提取以及利用 RT-PCR 进行FE-NDPK 在灭活病毒处理的 FE 细胞中的表达时序分析
2.5 FE-DCN 基因原核表达载体的构建及其在细菌中的诱导表达
2.6 FE-DCN 基因多克隆抗体的制备
2.7 westernblot blot 进行组织定量分析
2.8 FE-DCN 基因真核表达载体的构建以及在FE 细胞中瞬时表达
3. 实验结果
3.1 FE-DCN 基因全长cDNA 的克隆
3.2 氨基酸序列分析
3.3 RT-PCR 分析 FE-DCN 基因在牙鲆不同组织中的分布情况
3.4 灭活SMRV 处理的牙鲆 FE 细胞中的FE-DCN 表达时序分析
3.5 FE-DCN 基因在大肠杆菌中的诱导表达
3.6 利用western blot 对牙鲆 FE-DCN 表达产物进行组织分布分析
3.7 FE-DCN 基因在牙鲆培养细胞中的瞬时表达
4. 讨论
参考文献
总结
发布时间: 2005-12-02
参考文献
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