影响猪体细胞克隆胚胎发育能力的因素研究

论文题目: 影响猪体细胞克隆胚胎发育能力的因素研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物遗传育种与繁殖

作者: 潘登科

导师: 吴常信,李宁

关键词: 卵母细胞体外成熟,核移植,氧浓度,细胞数

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 体细胞克隆猪在人的动物疾病模型和人类异种器官移植方面具有巨大的优势和应用潜力,已成为当今体细胞克隆领域研究的热点。虽然体细胞克隆猪在几个国家已经取得成功,但是其克隆效率很低（<1%）。本研究以建立高效的猪体细胞核移植体系为目的,系统研究了影响核移植效率的因素,通过优化技术,改善培养条件,达到稳定大量地生产克隆胚胎,并进行胚胎移植以期获得克隆猪的出生。 本研究首先建立了中国实验用小型猪（香猪）的胎儿成纤维细胞、成年耳成纤维细胞和颗粒细胞三种细胞系,并对胎儿成纤维细胞系的染色体倍性及其对细胞周期同期化处理的反应进行了研究。染色体倍性检测表明,在传代10次之前,胎儿成纤维细胞染色体数目止常倍性率在90%以上。比较了血清饥饿和接触抑制诱导胎儿成纤维细胞进入G0/G1期的效率,发现二者差异不显著（P>0.05）,血清饥饿2d和4d差异不显著（P>0.05）,同样接触抑制2d和4d差异也不显著（P>0.05）。 以香猪胎儿成纤维细胞、耳成纤维细胞和颗粒细胞三种细胞为核供体进行核移植。对供体细胞血清饥饿与否、细胞形态、细胞类型及个体差异等影响克隆效率的供体冈素研究表明:血清饥饿处理对克隆胚的早期发育没有明显的促进作用;选择圆形光滑的细胞有利于提高融合率;不同个体不同类型的供体细胞对克隆的效率有一定的影响。 尝试性地以转染了质粒pEGFP-N1的猪胎儿成纤维细胞与体外成熟猪卵母细胞构建克隆胚胎,得到了转GFP的囊胚,囊胚率在5.9～12.5%。与非转基因细胞相比,转GFP细胞为核供体对囊胚率的形成无明显影响。 在卵母细胞成熟上首次尝试使用了一种新的培养基PZM,尽管成熟率不高,但成熟的卵母细胞的孤雌发育能力与常规成熟培养基NCSU-23相比无差异,两种培养基仍以NCSU-23成熟为好。NCSU-23、PZM两种培养基在低氧下成熟培养卵母细胞时,不能提高孤雌胚发育能力。在高低氧浓度（7%O2和20%O2）下培养孤雌胚胎,低氧（7%O2）条件下提高了囊胚率和囊胚的细胞数,其中PZM-3能显著提高囊胚细胞数（P<0.05）。 通过卵母细胞的体外成熟和孤雌激活的大量实验,优化了卵母细胞成熟和孤雌发育的方案:抽吸卵巢上3-4mm的卵泡,挑选A级卵丘细胞一卵母细胞复合体（COCs）培养,成熟培养后严格挑选卵黄膜完整、胞质均匀,卵周隙清楚、排出第一极体的成熟卵母细胞进行激活,培养在7%O2的气相下PZM-3培养基中,胚胎密度为每微升培养液2个胚胎,可显著提高孤雌胚胎的囊胚率和囊胚细胞数。 在核移植方案上,探索了卵龄和激活方案对猪体细胞核移植效率的影响,认为卵母细胞成熟时间42h时盲吸去核和低钙(0.1mM Ca2+)一次融合激活是本实验的优化方案。 在优化了以上各个环节的基础上,改进了克隆胚胎培养系统。本研究首次利用低氧条件（7%O2）下培养成熟的猪卵母细胞为受体,进行体细胞核移植。与高氧（20%O2）的气相条件相比,克隆胚胎的囊胚率和囊胚细胞数得到了显著提高（P<0.05）。在克隆胚的体外培养方面,系统地比较了低、高氧浓度（7%O2 vs 20%O2）和三种培养基NCSU-23、PZM-3、G3对胚胎发育的影

论文目录:

摘要

ABSTRACT

第一章 文献综述

一 哺乳动物体细胞核移植的基本理论及应用价值

二 猪体细胞克隆的研究进展

三 影响猪核移植效率的几个因素

四 影响猪卵母细胞体外成熟和胚胎体外培养的因素

第二章 影响猪体细胞克隆胚胎发育能力的因素：供体细胞

第一节 供核体细胞系的建立

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二节 供体细胞对核移植胚胎发育的影响

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 影响猪体细胞克隆胚胎发育能力的因素：卵母细胞

第一节 卵母细胞体外成熟和孤雌激活的研究

前言

1 材料与方法

2 实验设计及数据分析

3 结果

4 讨论

第二节 卵龄和激活方案对核移植效率的影响

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第四章 体细胞核移植生产转GFP的囊胚

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第五章 培养系统对猪体细胞克隆的影响

前言

1 材料与方法

2 实验设计及数据分析

3 结果

4 讨论

第六章 猪体细胞克隆囊胚的差异染色及后期发育

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第七章 结论

参考文献

附录

个人简历

致谢

发布时间: 2005-07-18

参考文献

• [1].羊体细胞克隆技术的优化及其应用研究[D]. 李欣欣.内蒙古大学2016
• [2].体细胞克隆山羊表观遗传修饰与基因表达特征研究[D]. 邢宝松.南京农业大学2007
• [3].组蛋白乙酰化在体细胞克隆牛肺脏中的研究[D]. 张磊.中国农业大学2004
• [4].和牛体细胞克隆技术的研究与应用[D]. RI KWANG IL.中国农业科学院2015
• [5].牛体细胞克隆中异常重编程的分析及提高重编程效率的研究[D]. 苏建民.西北农林科技大学2012
• [6].牛体外受精胚胎及克隆胚胎发育过程中组蛋白修饰表观遗传重编程的研究[D]. 吴侠.内蒙古大学2008
• [7].优化核移植技术并生产转人溶菌酶和β-防御素-3克隆牛的研究[D]. 王勇胜.西北农林科技大学2009
• [8].TET介导猪体外受精卵和体细胞克隆胚的去甲基化研究[D]. 聂晓伟.南京医科大学2014

相关论文

• [1].猪体细胞核移植及几个相关问题的研究[D]. 孙兴参.东北农业大学2001
• [2].小鼠化学去核卵母细胞支持供体细胞核体外发育的研究[D]. 杜卫华.中国农业大学2004
• [3].猪腮腺分泌蛋白表达特性及表达调控元件的研究[D]. 田兴华.中国农业大学2005
• [4].猪转化生长因子β1基因多态性与猪产仔数关系的研究[D]. 武艳萍.中国农业大学2005
• [5].小鼠体细胞核移植和胚胎分割相关问题研究[D]. 白照岱.山东大学2004
• [6].小鼠胚胎细胞和体细胞核移植及原核置换研究[D]. 张刚.山东师范大学2005
• [7].不借助于显微操作仪的小鼠体细胞核移植技术研究[D]. 马所峰.山东农业大学2005
• [8].猪体细胞核移植相关技术研究[D]. 黄雅琼.广西大学2008

标签：卵母细胞体外成熟论文;  核移植论文;  氧浓度论文;  细胞数论文;