蚯蚓纤溶酶组分糖链的基本结构及免疫学性质研究

论文摘要

以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基,Sepharose-4B为载体的亲和层析从赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）匀浆液中分离出了蚯蚓纤溶酶全组分,用DEAE-Cellulose-52离子交换层析法和制备电泳法分离纯化了蚯蚓纤溶酶各单组分（其中EfP-Ⅲ-1,EfP-Ⅲ-2为待研究目的组分）,ConA转移印迹和LCA,AAL点印迹法证明EfP-Ⅲ-1,EfP-Ⅲ-2的寡糖链都含有甘露糖和核心岩藻糖结构,EfP-Ⅲ-1,EfP-Ⅲ-2经三氟甲基磺酸（TFMS）去糖基化后失去了抵抗胰蛋白酶水解的能力。分别以TFMS去糖基化前后的蚯蚓纤溶酶全组分为抗原免疫家兔,通过酶联免疫法和转移印迹法证明两种抗原的免疫原性和免疫反应性均没有明显的差异。以小分子可逆抑制剂苯甲脒抑制EfP-Ⅲ-1,EfP-Ⅲ-2的活性,通过纤维蛋白平板法测得苯甲脒对EfP-Ⅲ-1,EfP-Ⅲ-2的半数抑制剂量I50分别为2.03μmol和1.48μmol。以6mol／L尿素为洗脱剂,将酶与苯甲脒的混合液用Sephadex G-25分子筛成功分离,BAEE法测定了EfP-Ⅲ-1，EfP-Ⅲ-2的活力恢复分别为62.68%和65.12%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 蚯蚓纤溶酶
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 研究概况
• 1.2 糖蛋白及其分析手段
• 1.2.1 糖链的合成
• 1.2.2 糖链的鉴定与分离
• 1.3 前期研究、本论文的主要研究内容及意义
• 第2章 蚯蚓纤溶酶全组分（EFEs）的分离制备
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 蚯蚓纤溶酶全组分的纯化
• 2.2.2 PAGE检测蚯蚓纤溶酶全组分
• 第3章 蚯蚓纤溶酶单组分的分离纯化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器
• 3.1.4 方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 DEAE-Cellulose-52层析分离蚯蚓纤溶酶图谱
• 3.2.2 天然电泳检测DEAE-Cellulose-52层析峰
• 3.2.3 制备电泳对单组分的纯化
• 3.3 小结
• 第4章 蚯蚓纤溶酶糖链分析及其对酶性质的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.1.4 方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 凝集素法分析蚯蚓纤溶酶糖链结构
• 4.2.2 TFMS去糖基化
• 4.2.3 TFMS去糖基化前后EfP-Ⅲ-1,EfP-Ⅲ-2对胰蛋白酶的抗性
• 4.2.4 TFMS去糖基化前后EFEs的免疫原性
• 4.2.5 TFMS去糖基化前后EFEs,EfP-Ⅲ-1,EfP-Ⅲ-2的免疫反应性
• 4.3 小结
• 第5章 苯甲脒对EfP-Ⅲ-1,EfP-Ⅲ-2的可逆抑制
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 仪器
• 5.1.4 方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 不同蛋白酶抑制剂对组分EfP-Ⅲ-1和EfP-Ⅲ-2的抑制作用
• 5.2.2 纤维蛋白平板法检测苯甲脒对EfP-Ⅲ-1和EfP-Ⅲ-2的抑制作用
• 5.2.3 Sephadex G-25分子筛层析对酶和苯甲脒的分离
• 5.2.4 纤维蛋白平板法测定EfP-Ⅲ-1,EfP-Ⅲ-2的活力恢复
• 5.3 小结
• 第6章 结论
• Abbreviations
• 参考文献
• 致谢