产酶溶杆菌OH11菌株几丁质酶基因的功能研究

论文摘要

农业生产上非常重视对植物病害的防治。很多病害的防治主要依赖化学农药,但大量使用化学农药容易污染环境,危害人畜健康,同时导致病原菌杭性不断上升。而生物防治对人畜较安全,对环境污染也少,因此近年来受到了广泛的关注。产酶溶杆菌OH11是从辣椒根际土壤中筛选并分离到的一种新型生防菌株,能产生多种胞外酶,包括几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶和纤维素酶,对多种植物病原物有比较明显的抑制作用,作为生防菌的应用前景十分广阔。真菌的细胞壁由几丁质等物质组成,而OH11可以分泌几丁质酶降解几丁质,从而可以破坏真菌的细胞壁,抑制真菌的生长。因此,几丁质酶可能与OH11的生防作用密切相关。本课题根据已测序获得的OH11基因组信息和几丁质酶基因的序列,构建几丁质酶基因的敲除载体,通过双交换的方法,获得几丁质酶基因缺失突变体。几丁质平板检测显示,突变体△chiA已经完全丧失降解几丁质的能力。southern杂交是验证基因的拷贝数和缺失突变体的一个经典方法。以chiA内部605bp的片段作为探针,采用EcoRI和HindⅢ双酶切的方法,通过southern杂交,我们确定了chiA在OH11中是以单拷贝的形式存在的。以chiA下游518bp的片段作为探针,采用EcoRI和HindⅢ双酶切的方法,通过southern杂交,我们确定了△chiA是chiA缺失突变体。为了确定chiA在OH11生防过程中的作用,我们对几丁质酶基因缺失突变体△chiA和野生型OH11进行了平板拮抗实验。结果显示,△chiA和野生型OH11对6种病原菌的拮抗能力几乎相同。由此我们可以得出结论：chiA不是OH11生防功能的决定性因子。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 溶杆菌防治植物病害的研究进展
• 1 分类与鉴定
• 2 生境及生态学
• 3 溶杆菌的拮抗及生防机理
• 3.1 胞外酶
• 3.2 次生代谢
• 3.3 诱导抗性
• 3.4 Clp调控的性状
• 3.5 三型泌出系统（T3SS）
• 第二章 生物防治系统及应用前景
• 1 生物防治系统
• 2 菌剂创制
• 3 前景展望
• 第二部分 研究内容
• 第一章 产酶溶杆菌OH11几丁质酶基因的敲除
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 敲除载体构建及验证
• 2.2 一次交换子的获得
• 2.3 二次交换子的获得
• 2.4 几丁质平板检测几丁质酶的产生情况
• 3 讨论
• 第二章 产酶溶杆菌OH11几丁质酶基因缺失突变体的southern杂交验证
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果
• 2.1 chiA在野生型OH11中的拷贝数
• 2.2 突变体△chiA的southern杂交验证
• 3 讨论
• 第三章 产酶溶杆菌OH11几丁质酶基因缺失突变体的抑菌功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 发表的论文
• 致谢