人类锌指蛋白新基因ZNF328的克隆与功能研究

论文摘要

转录因子在多种细胞功能中担任了重要角色,包括细胞生长、增殖、凋亡和细胞内的信号转导。人们已经鉴定了几个大的转录因子家族。在哺乳动物中,含KRAB结构域的锌指蛋白（KRAB-ZFP）家族是人类基因中最大的一类转录因子,研究表明许多KRAB-ZFP基因与心脏发育以及心血管疾病都有关系。我们从人类胚胎心脏cDNA文库中克隆鉴定了一个锌指基因,经国际基因命名委员会批准命名为ZNF328。该基因全长4511bp,其开放阅读框（ORE）长2376bp,编码了792个氨基酸,在N端含有一个KRAB框,C端含有15个C2H2型锌指。ZNF328由8个外显子组成,在基因组上跨越大约28kb,其中外显子6、7分别编码了KRAB框的A和B框;ZNF328位于染色体带19q13.4上。Nortern blot分析该蛋白在大部分的成体和胚胎组织中都有表达。亚细胞定位分析表明ZNF328蛋白定位在细胞核中。用Gal-4 DNA结合系统对ZNF328进行转录分析,说明该基因是个转录抑制因子,结构域分段分析表明KRAB框起主要的抑制作用。在COS-7细胞中过表达ZNF328抑制了SRE和AP-1的转录活性,而这两种因子是MAPK信号途径介导的重要因子,说明ZNF328蛋白可能在MAPK信号途径中作为抑制因子介导细胞功能。为了观察新基因过表达后细胞蛋白质表达的改变,构建了pCMV-Tag2B-ZNF328真核表达载体,应用脂质体转染技术,将ZNF328基因导入HeLa细胞系中,通过G418筛选,并经PT-PCR鉴定,鉴定了稳定表达的细胞系。提取稳定转染细胞的总蛋白,采用双向凝胶电泳分离细胞蛋白质,

论文目录

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• 第一章 引言和文献综述
• 1、心脏的形成
• 2、心脏发育与转录因子
• 3、锌指家族的简介以及与心脏发育的关系
• 3.1 锌指的DNA结合功能域
• 3.2 锌指蛋白的分类和结构特征
• 3.3 锌指蛋白和心脏发育的关系
• 3.3.1 GATA家族基因
• 3.3.2 NKx2家族基因
• 3.3.3 HF1b基因
• 4、MAPK的简介及其和心血管的关系
• 4.1 MAPK信号转导途径
• 4.1.1 MAPK途径基本特点
• 4.1.2 MAPK的四种主要途径
• 4.1.3 MAPK途径特异性的实现
• 4.2 MAPK信号途径和心血管发育及心血管疾病
• 5、本文的研究意义
• 第二章 新基因ZNF328的克隆与表达分析
• 1、材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2、结果
• 2.1 新的锌指基因片段的获取和计算机克隆
• 2.2 ZNF328基因全长cDNA的克隆及序列分析
• 2.3 ZNF328基因的基因组结构分析
• 2.4 ZNF328蛋白质结构和功能的生物信息学分析
• 2.5 ZNF328基因的人类组织Northern杂交结果
• 2.6 ZNF328蛋白的亚细胞定位分析
• 2.7 ZNF328蛋白的转录活性分析
• 2.8 ZNF328蛋白在MAPK途径中的转录活性分析
• 2.9 ZNF328结构域片段拆除研究
• 2.10 转基因稳定表达细胞系的建立
• 第三章 其他研究工作
• 参考文献
• 致谢
• 附录