基因工程法制备兼具超氧化物歧化酶和谷胱甘肽还原酶活性的35肽

论文摘要

作为机体内的主要抗氧化酶,超氧化物歧化酶(SOD)与谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)不仅在活性上能协同作用,还能组成相互保护的防御群,更有效的清除机体内自由基,保护细胞免遭氧化损伤,维持体内代谢平衡。本项目拟将具有超氧化物歧化酶活性的17肽和具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的15肽通过3肽Linker串联起来,并通过天然酶活性部位氨基酸同源保守序列的比对、二级三级结构预测及分子动力学模拟进行优化,得到新的结构合理,催化机理明确的35肽序列。并利用E. coli掺入铜离子后的Cys营养缺陷型表达系统把双酶活性中心分别引入到N、C两端,制备出分子量小,透膜性好,免疫原性低,结构稳定的兼具SOD和GPx双功能酶活性的抗氧化酶。这不仅对阐明酶的催化机理以及相互间的协同作用有重要意义,而且还具有重大的药用价值。

论文目录

• 提要
• 第一章 序论
• 1.1 超氧化物歧化酶（SUPEROXIDE DISMUTASE,SOD,EC1.15.1.1）
• 1.2 过氧化氢酶（CATALASE,CAT,EC 1.11.1.6）
• 1.3 谷胱甘肽过氧化物酶（GLUTATHIONE PEROXIDASE,GPX,EC1.11.1.9）
• 1.3.1 乒乓机制
• 1.3.2 顺序机制
• 1.4 谷肽甘肽还原酶（GLUTATHIONE REDUCTASE,GR,EC 1.6.4.2）
• 1.5 抗氧化模拟酶
• 1.6 具有抗氧化协同作用的多功能模拟酶
• 1.6.1 兼具多功能酶活性的小分子化合物模型
• 1.6.2 兼具多功能酶活性的生物大分子蛋白模型
• 第二章 35肽的设计及构建
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 质粒和菌株
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 35肽氨基酸序列的设计
• 2.2.2 重叠PCR扩增目的基因
• 2.2.3 凝胶回收PCR产物
• 2.2.4 质粒提取
• 2.2.5 重组质粒的构建
• 2.2.6 测序
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 35肽氨基酸序列的设计
• 2.3.2 35肽的构建
• 2.3.3 GST融合表达系统
• 本章小结
• 第三章 双活性35肽的表达纯化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 质粒和菌株
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 融合蛋白在E.coli BL-21（DE3）的表达
• 3.2.2 融合蛋白的Cys缺陷型表达[79,80]
• 3.2.3 sjGST,sjGST-35P,sjGST-Se-35P的纯化
• 3.2.4 目的蛋白表达的同时引入Cu2+[81]
• 3.2.5 凝血酶裂解融合蛋白[82]
• 3.2.6 Tricine-SDS-PAGE[83]
• 3.2.7 蛋白含量的测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 硒代半胱氨酸的原核表达
• 3.3.2 铜离子的引入
• 本章小结
• 第四章 双活性35肽酶学性质的研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 GPx活力的测定[85]
• 4.2.2 SOD活力的测定[86]
• 4.2.3 GSH结合常数测定[87]
• 4.2.4 硒含量的测定
• 4.2.5 Cu2+含量的测定[89]
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 SOD和GPx活性
• 4.3.2 凝血酶裂解对Se-Cu-35P活性的影响
• 4.3.3 Se-Cu-35P的GPx动力学分析
• 4.3.4 Se-Cu-35P催化机理的假设
• 第五章 抗氧化协同效应的研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 主要试剂
• 5.1.2 主要仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 Se-Cu-35P抗H2O2失活能力的测定[90]
• 5.2.2 Se-Cu-35P对心肌线粒体的抗氧化损伤作用
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 Se-Cu-35P抗H2O2失活能力的测定
• 5.3.2 Se-Cu-35P对损伤线粒体膨胀度的影响
• 5.3.3 Se-CuZn-65P对损伤线粒体脂质过氧化的抑制
• 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT