壳寡糖的酶法制备分析及其初步分离

论文摘要

壳聚糖有丰富的资源,在食品、医药、环保领域有广泛的应用,但壳聚糖的分子量大、水溶性差,限制了它的应用。壳寡糖是其降解产物,它不但保留了壳聚糖的某些功能特性,还有良好的水溶性等特点,更具有应用价值。酶法降解是广泛使用的降解方法,可选择特异性的切断β-1,4糖苷键,反应条件温和、过程易控制,可通过条件的控制得到不同分子量范围的壳寡糖。本课题以实验室保藏的一株产壳聚糖酶菌株Mitsuaria sp.141-2为研究对象,主要围绕酶法降解壳聚糖的方向展开工作,首先对菌株产酶的发酵阶段进行优化来提高酶活,继而对该酶降解壳聚糖底物的条件进行优化,然后对酶解产物进行了分析检测,最后对酶解产物进行初步的分离纯化。具体研究结果如下：1、采用菌体富集和诱导产酶两步法对菌株发酵阶段进行优化,菌体富集阶段优化后的培养条件为：2.5%葡萄糖,0.9%蛋白胨,0.14%K2HPO4,0.06%KH2PO4, 0.1%MgSO4,180 mL/1000 mL,30℃,180 rpm;优化后的诱导条件为：1.5%的壳聚糖底物诱导3 d。最终,菌浓度是起始条件的3倍,酶活由最初的3.5 U/mL提高到了6.1 U/mL。2、采用单因素实验对酶解条件进行了优化。最适条件为：底物浓度3%,pH5.2～5.6,温度65℃,加酶量7 U/g壳聚糖。该酶适合降解脱乙酰度居中（85%左右）的壳聚糖。3、对酶解产物进行了分析检测。通过水解产物的TLC图和平均聚合度联系可得,该酶主要以内切方式随机水解壳聚糖,酶解产物为不同聚合度壳寡糖的混合物。本研究还摸索出了通过选择不同的加酶量和酶解时间得到所需分子量的壳寡糖的方法。4、对低聚壳聚糖进行了初步分离。采用乙醇分布沉淀法对酶解产物进行初步分离,75%乙醇沉淀即可除去聚合度约为9以上的壳聚糖,87.5%乙醇沉淀则可除去聚合度约为7以上的壳聚糖。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 壳聚糖的结构与性质
• 1.2 壳寡糖的性质与应用
• 1.2.1 壳寡糖概述
• 1.2.2 壳寡糖的制备
• 1.2.2.1 化学法
• 1.2.2.2 物理法
• 1.2.2.3 酶解法
• 1.2.3 壳寡糖的应用
• 1.3 本课题研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 主要药品与试剂
• 2.1.2.1 壳聚糖
• 2.1.2.2 主要试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要设备仪器
• 2.2 分析方法
• 2.2.1 壳聚糖酶酶活的测定
• 2.2.2 生物量的测定
• 2.2.3 还原糖浓度的测定
• 2.2.4 酶解产物薄层层析（TLC）分析
• 2.2.5 酶解产物的平均聚合度的检测
• 2.2.6 壳寡糖样品的数均分子量的测定
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 产壳聚糖酶菌株Mitsuaria sp.141-2发酵产酶两步法的探索
• 2.3.1.1 在壳聚糖培养的条件下该菌的生长曲线和产酶曲线的测定
• 2.3.1.2 菌体生长和诱导产酶两步法可行性探究实验
• 2.3.1.3 菌体富集发酵条件的优化
• 2.3.1.4 诱导条件的优化
• 2.3.2 壳聚糖酶解条件的优化
• 2.3.2.1 壳聚糖酶液的制备
• 2.3.2.2 壳聚糖底物的预处理
• 2.3.2.3 酶解条件的优化
• 2.3.3 酶解产物的分析检测
• 2.3.3.1 酶解不同时间的产物的TLC分析
• 2.3.3.2 壳聚糖平均聚合度随水解时间的变化
• 2.3.3.3 壳聚糖酶解样品的红外光谱分析
• 2.3.3.4 酶解产物的HPLC分析
• 2.3.3.5 乙酰丙酮法测定壳寡糖的数均分子量
• 2.3.4 低聚壳聚糖的初步提取分离及分析
• 2.3.4.1 初步提取分离
• 2.3.4.2 提取物的薄层层析
• 2.3.4.3 提取物平均聚合度以及数均分子量的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 产壳聚糖酶菌株Mitsuaria sp.141-2发酵产酶两步法的探索
• 3.1.1 氨基葡萄糖标准曲线及壳聚糖酶活力计算公式
• 3.1.2 在壳聚糖培养的条件下该菌的生长曲线和产酶曲线的测定
• 3.1.3 菌体生长和诱导产酶两步法可行性探究实验
• 3.1.4 菌体富集发酵条件的优化
• 3.1.4.1 不同碳源对生物量的影响
• 3.1.4.2 碳源浓度对生物量的影响
• 3.1.4.3 不同氮源对生物量的影响
• 3.1.4.4 氮源浓度对生物量的影响
• 3.1.4.5 pH对生物量的影响
• 3.1.4.6 装液量对生物量的影响
• 3.1.5 诱导条件的优化
• 3.1.5.1 不同诱导物对产酶的影响
• 3.1.5.2 诱导物浓度对产酶的影响
• 3.2 壳聚糖酶解条件的优化
• 3.2.1 酶解时间的确定
• 3.2.2 最适底物浓度的确定
• 3.2.3 最适pH的确定
• 3.2.4 最适酶解温度的确定
• 3.2.5 酶解最适加酶量的确定
• 3.2.6 不同脱乙酰度壳聚糖底物对酶解的影响
• 3.3 酶解产物的分析检测
• 3.3.1 酶解不同时间的产物的TLC分析
• 3.3.2 壳聚糖聚合度随水解时间的变化
• 3.3.3 壳聚糖水解产物的红外光谱分析
• 3.3.4 酶解产物的HPLC分析
• 3.3.5 乙酰丙酮法测定壳寡糖的数均分子量
• 3.4 低聚壳聚糖的初步提取分离
• 3.4.1 提取物的薄层层析
• 3.4.2 提取物聚合度和数均分子量的测定
• 4 小结与讨论
• 4.1 壳聚糖酶发酵条件的优化
• 4.2 壳聚糖酶解条件的优化及产物的分析检测
• 4.3 低聚壳聚糖的初步分离
• 4.4 下一步研究方向
• 参考文献
• 致谢
• 附录