荔枝类甜蛋白基因克隆与表达分析

论文摘要

荔枝（Litchi chinensis Sonn）是重要的热带果树之一,但果皮褐变及采后病害等降低了果实的商品价值,限制着荔枝产业的发展。研究不同品种采后品质变化机制可为控制采后损失提供理论依据。类甜蛋白（TLP）属于病程相关蛋白PR5家族,在多数植物中的研究表明,该基因表达具有组织特异性,与作物抗病、耐旱等有着密切关系。克隆荔枝TLP基因（LTLP）,深入研究其在不同品种果皮发育及衰老过程中的表达规律,可望揭示该基因与果皮衰老的关系,从而为该基因在荔枝育种中的应用提供基础。通过对海南6个荔枝主栽品种的耐贮性比较发现,紫娘喜最耐贮藏,无核荔枝不耐贮藏。不同处理影响采后衰老进程,低温和保湿可以延缓果实衰老的进程。通过PCR方法从耐贮性不同的三个品种荔枝中得到类甜蛋白基因（LTLP） cDNA全长和ORF对应的DNA序列。ORF对应的cDNA和DNA序列一致,不含内含子,但三个品种的LTLP序列存在单核苷酸多态性。该基因cDNA序列是编码223个氨基酸残基的多肽链,与杨毛果、蓖麻、猕猴桃等的TLP蛋白的氨基酸序列具有较高的一致性。Southerm杂交进一步证实所克隆的LTLP确实来自荔枝,是双拷贝基因。基因枪轰击洋葱表皮瞬时表达GFP融合基因表明,该基因在细胞外表达。克隆了LTLP基因ATG上游2103bp启动子区,序列分析表明,LTLP启动子转录起始位点可能在ATG上游2003-2053bp范围内,其ATG上游21bp和99bp分别TATA盒和·CAAT盒,其核心启动区可能就在其区域。LTLP启动子含有ABRE、CGTCA-motif、HSE、TCT-motif等元件。ABRE为脱落酸响应的顺式作用因子ABA反应元件。构建了启动了序列缺失片段植物表达载体,为进一步研究LTLP表达和启动子功能提供了基础。LTLP在荔枝果皮、果肉、花、茎、叶、种子中均有表达。其中,果肉、茎、叶的表达量较低,在花中的表达量较高,推测LTLP可能在许多不同的生理过程中都起作用,并且与发育成熟度密切相关。在果实从发育到衰老的整个过程中,果皮中LTLP表达先上升后下降,采后表达量高于采前。室温下,LTLP在果皮中表达随贮藏时间的延长和果皮褐变程度加剧,呈先升后降趋势。在耐贮性不同的品种中,紫娘喜中LTLP表达最高,说明不同品种褐变进程的差异与其内部LTLP表达呈负相关。控制果皮失水能提高采后果皮中LTLP衣达,而低温则抑制LTLP表达。低温处理时不同品种的LTLP表达量都较低。真菌侵染能旅导LTLP表达,说明该基因的表达可能与采后病程防御反应相关。这些结果表明,LTLP苦因表达与荔枝果皮采后衰老有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 荔枝概述
• 1.1.1 荔枝的生理学特性和分类
• 1.1.2 荔枝的食用价值和经济价值
• 1.2 荔枝采后生理变化
• 1.2.1 荔枝果实采后的呼吸变化
• 1.2.2 采后荔枝果实品质的变化
• 1.3 荔枝采后果皮褐变的可能机理
• 1.3.1 失水褐变
• 1.3.2 酶促褐变
• 1.3.3 花色苷
• 1.3.4 微生物引起的褐变
• 1.4 类甜蛋白的研究进展
• 1.4.1 TLP的结构与功能之间的关系
• 1.4.1.1 TLP的三维结构
• 1.4.1.2 TLP的β-1,3葡聚糖酶活性
• 1.4.1.3 TLP的分子生物学研究
• 1.4.1.4 TLP基因在转基因工程中的研究现状
• 1.6 本研究的目的意义
• 1.7 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 实验菌种与载体
• 2.1.3 化学试剂
• 2.1.4 生化制剂
• 2.1.5 分子生物学试剂盒
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 果实处理与取样方法
• 2.2.1 不同荔枝品种耐贮性比较
• 2.2.2 不同处理对妃子笑果实品质的影响
• 2.2.3 低温处理对不同耐贮性品种品质的影响
• 2.2.4 炭疽侵染处理
• 2.2.5 果实发育动态观察
• 2.3 采后生理指标测定
• 2.3.1 果皮褐变指数
• 2.3.2 果实失重率测定
• 2.3.3 果皮失水率测定
• 2.3.4 果皮PH值
• 2.3.5 果皮相对电导率的测定
• 2.3.6 丙二醛（MDA）含量的测定
• 2.3.7 果皮花色苷的测定
• 2.4 类甜蛋白LTLP克隆与表达分析
• 2.4.1 核酸提取
• 2.4.1.1 荔枝基因组DNA的提取（改良CTAB法）
• 2.4.1.2 荔枝不同器官总RNA提取（改良CTAB法）
• 2.4.2 cDNA第一链的合成
• 2.4.3 荔枝LTLP-cDNA克隆
• 2.4.3.1 引物设计
• 2.4.3.2 反应体系
• 2.4.3.3 反应程序
• 2.4.3.4 目的片段的回收
• 2.4.3.5 回收产物与pMD18-T vector连接（参照TaKaRa说明书）
• 2.4.3.6 E.coli DH5α感受态细胞的制备
• 2.4.3.7 连接产物转化E.coli DH5α
• 2.4.3.8 重组质粒DNA的小量提取
• 2.4.3.9 重组质粒的PCR和酶切鉴定及测序
• 2.4.4 荔枝LTLP-DNA克隆
• 2.4.4.1 引物设计（同2.4.3.1）
• 2.4.4.2 反应体系
• 2.4.4.3 反应程序、目的片段的回收、连接、转化、质粒提取、鉴定
• 2.4.5 荔枝LTLP启动子克隆
• 2.4.5.1 引物设计（参照TAKARA Genome Walking Kit）
• 2.4.5.2 体系和反应程序
• 2.4.5.2.1 第一轮PCR反应
• 2.4.5.2.2 第二轮PCR反应
• 2.4.5.2.3 目的片段的回收、连接、转化、质粒提取、鉴定
• 2.4.6 Southern blot分析
• 2.4.7 LTLP植物表达载体的构建
• 2.4.7.1 引物的设计
• 2.4.7.2 目的片段的扩增
• 2.4.7.3 目的片段的回收
• 2.4.7.4 目的片段的酶切
• 2.4.7.5 目的片段的再次回收
• 2.4.7.6 pCAMBIA1302载体的获得
• 2.4.7.7 目的片段和pCAMBIA1302载体的连接
• 2.4.7.8 感受态的制备、转化、重组质粒的筛选和鉴定、测序
• 2.4.8 利用基因枪转化法将pCAMBIA1302-LTLP载体转入洋葱表皮细胞
• 2.4.8.1 材料处理
• 2.4.8.2 pCAMBIA1302-LTLP和pCAMBIA1302质粒提取
• 2.4.8.3 微弹制备（王关林等,2002）
• 2.4.8.4 基因枪轰击洋葱材料
• 2.4.9 荧光定量RT-PCR分析LTLP表达量
• 2.4.9.1 cDNA第一链的合成
• 2.4.9.2 荧光定量PCR的引物设计
• 2.4.9.3 荧光定量PCR的反应体系和反应程序
• 2.4.9.4 荧光定量PCR的定量方法
• 2.4.10 启动子缺失载体构建
• 3 结果与分析
• 3.1 不同荔枝品种生理变化的比较
• 3.1.1 不同品种荔枝果实贮藏过程中褐变指数和好果率的变化
• 3.1.2 不同品种荔枝果实贮藏过程中果实失重率测定
• 3.1.3 不同品种荔枝果实贮藏过程中果皮累计失水率的变化
• 3.1.4 不同品种荔枝果实贮藏过程中果皮pH值的变化
• 3.1.5 果皮花色苷的变化
• 3.1.6 不同品种荔枝果实贮藏过程中果皮MDA和相对电导率含量的变化
• 3.2 不同贮藏条件下"妃子笑"生理变化的比较
• 3.2.1 不同贮藏条件下"妃子笑"褐变指数和好果率的变化
• 3.2.2 不同贮藏条件下"妃子笑"果皮累计失水率的变化
• 3.2.3 不同贮藏条件下"妃子笑"果皮pH值的变化
• 3.2.4 不同贮藏条件下"妃子笑"果皮花色苷含量的变化
• 3.2.5 不同贮藏条件下"妃子笑"果皮MDA和相对电导率含量的变化
• 3.3 低温对不同耐贮性品种生理变化的影响
• 3.3.1 低温对不同耐贮性品种褐变指数的影响
• 3.3.2 低温对不同耐贮性品种果皮累计失水率的影响
• 3.3.3 低温对不同耐贮性品种果皮pH的影响
• 3.3.4 低温对不同耐贮性品种果皮相对电导率影响
• 3.3.5 低温对不同耐贮性品种果皮丙二醛含量的影响
• 3.3.6 低温对不同耐贮性品种果皮花色苷含量的影响
• 3.4 LTLP克隆与序列分析
• 3.5 妃子笑、无核、紫娘喜的CDNA序列比较和GDNA序列比较
• 3.6 LTLP推导的氨基酸残基序列分析
• 3.6.1 LTLP推导的氨基酸序列比较与理化性质分析
• 3.6.2 同源性分析
• 3.6.3 蛋白质三级结构
• 3.7 LTLP瞬时表达
• 3.7.1 LTLP蛋白定位特征
• 3.7.2 LTLP表达载体的构建
• 3.7.3 LTLP表达产物的亚细胞定位
• 3.8 SOUTHERN BLOT分析
• 3.9 LTLP启动子克隆和序列分析
• 3.9.1 LTLP启动子序列生物信息学分析
• 3.10 启动子缺失载体构建
• 3.10.1 不同启动子缺失片段的扩增
• 3.10.2 PBI-121-启动子重组质粒的验证
• 3.11 LTLP表达分析
• 3.11.1 LTLP组织特异性表达分析
• 3.11.2 妃子笑动态发育过程中果皮LTLP表达分析
• 3.11.3 不同贮藏条件下妃子笑果皮中LTLP表达分析
• 3.11.4 室温贮藏条件下三个品种果皮中LTLP表达分析
• 3.11.5 低温贮藏条件下三个品种果皮中LTLP表达分析
• 3.11.6 炭疽侵染妃子笑果皮LTLP表达分析
• 4 讨论
• 4.1 LTLP序列分析
• 4.1.1 LTLP基因克隆和分析
• 4.1.2 LTLP蛋白定位于细胞内
• 4.1.3 LTLP启动子克隆和分析
• 4.2 荔枝衰老的过程中的生理变化
• 4.2.1 不同荔枝品种耐贮性比较
• 4.2.2 不同贮藏条件下荔枝生理变化的比较
• 4.3 LTLP与荔枝发育衰老的关系
• 4.3.1 LTLP在荔枝不同器官的差异表达分析
• 4.3.2 LTLP在荔枝动态发育过程中表达分析
• 4.3.3 LTLP与荔枝果皮失水关系
• 4.3.4 LTLP表达与低温关系
• 4.3.5 LTLP表达与病害的关系
• 4.3.6 LTLP表达与失水、保湿、低温、病害之间的相互关系
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢