Nisin高产菌株的选育及其发酵条件的优化

论文摘要

Nisin是一种由微生物代谢产生的天然抗菌肽,由34个氨基酸组成,能有效地抑制引起食品腐败的许多革兰氏阳性菌及其芽孢的生长,是世界卫生组织和联合国粮农组织批准使用的食品防腐剂,目前已在50多个国家和地区广泛使用。Nisin对蛋白酶特别敏感,在消化道中能很快被α-胰凝乳蛋白酶所降解,对人体安全无毒。同时作为食品防腐剂应用的四十多年来,Nisin没有诱发大范围的抗性,这使得其生物合成受到广泛关注。1953年,Nisin由英国的Aplin&Barrett公司最早实现工业化生产。经过五十多年的发展,有报道称英国Nisin生产水平已达到8000 IU/mL。我国在此领域相对比较落后,国内报道的Nisin生产菌株效价一般在4000IU/mL左右,与国外报道有很大的差距。目前,对Nisin的研究大多集中在培养基优化和发酵条件优化两个方面,Nisin生产菌株的效价较低是限制其在国内广泛应用的主要原因。本研究以乳酸链球菌ATCC11454为出发菌株,经紫外线、微波、亚硝酸钠及亚硝基胍复合诱变处理,并采用Nisin作为抗性筛选剂,结合双层琼脂扩散法,最终选育出一株Nisin高产菌株,将其命名为乳酸链球菌E-15。该菌株Nisin效价达到6200IU/mL,较原始菌株提高了5倍。传代试验证明菌株的遗传特性稳定。对菌株的摇瓶发酵条件进行研究,确定了Nisin最佳的发酵培养基组成及培养条件。得到的Nisin最优培养基配方为：蛋白胨20gL,酪蛋白胨15gL,水解乳蛋白15gL,蔗糖30 g/L, MgSO4·7H2O 0.2 g/L, KH2PO410 g/L, NaCl 2 g/L,吐温-801mL/L, pH值为6.8,121℃灭菌20min。考察了接种量、发酵时间对乳链菌肽发酵的影响。最优培养条件为：接种量为5%,发酵时间为28 h。利用10 L自动控制发酵罐进行乳酸链球菌E-15的放大试验,进行了pH反馈控制的厌氧补料发酵。利用pH反馈控制的原理,将蔗糖与氢氧化钠的混合溶液以一定的速度补加到发酵罐中,维持pH值在6.5左右,控制发酵罐内的蔗糖含量稳定的维持在10～15gL,发酵28 h Nisin的效价达到9600 IU/mL。对Nisin的提取工艺进行了研究,确定了使用板框过滤机对发酵液进行过滤,除菌后发酵液采用孔径为3000 Da的超滤膜超滤得到浓缩液,喷雾干燥得到成品,回收率高达96.1%。

论文目录

• 目录
• CATALOGUE
• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 绪论
• 1 Nisin的性质
• 1.1 理化性质
• 1.2 酶解性质
• 1.3 抑菌性
• 1.4 安全性
• 2 Nisin的发酵生产
• 2.1 Nisin菌株的筛选
• 2.2 Nisin高产菌株的选育
• 2.3 Nisin发酵条件的研究
• 3 Nisin的应用
• 3.1 Nisin在食品工业的应用
• 3.2 Nisin在农业的应用
• 3.3 Nisin在医药行业的应用
• 4 Nisin的研究前景
• 5 本论文的研究背景和研究内容
• 第二章 复合诱变选育Nisin高产菌株
• 1 材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 主要仪器
• 1.3 试剂
• 1.4 培养基
• 1.5 所需溶液的配制
• 2 实验方法
• 2.1 实验基本步骤
• 2.2 出发菌株生长曲线的测定
• 2.3 Nisin效价标准曲线的绘制
• 2.4 Nisin效价的测定
• 2.5 原始菌株ATCC11454发酵效价及Nisin抗性的测定
• 2.6 紫外诱变
• 2.7 微波诱变
• 2.8 亚硝酸钠诱变
• 2.9 亚硝基胍诱变
• 2.10 诱变抗性平板中Nisin浓度的确定
• 2.11 高产菌株的筛选
• 2.12 菌株遗传稳定性实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 原始菌株ATCC11454生长曲线的测定
• 3.2 Nisin效价标准曲线的绘制
• 3.3 原始菌株效价及Nisin抗性的测定
• 3.4 抗性平板中Nisin浓度确定结果
• 3.5 紫外诱变致死率的测定
• 3.6 紫外诱变选育的结果
• 3.7 菌株UV-8生长曲线测定结果
• 3.8 微波诱变中降温时间的测定结果
• 3.9 微波诱变致死率的测定
• 3.10 微波诱变选育的结果
• 3.11 MW-109生长曲线的测定结果
• 3.12 亚硝酸钠诱变致死率的测定
• 3.13 亚硝酸钠诱变选育的结果
• 3.14 NA-123生长曲线的测定结果
• 3.15 亚硝基胍诱变致死率的测定
• 3.16 亚硝基胍诱变选育的结果
• 3.17 菌种稳定性实验结果
• 3.18 原始菌株ATCC11454与高产菌株E-15比较
• 4 本章小结
• 第三章 Nisin高产菌株发酵条件的优化
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要仪器
• 1.3 试剂
• 1.4 培养基
• 2 实验方法
• 2.1 发酵液残糖的计算
• 2.2 单因素实验优化Nisin发酵培养基
• 2.3 Nisin发酵条件的优化
• 2.4 Nisin发酵罐中发酵工艺的研究
• 3 结果与讨论
• 3.1 单因素实验优化Nisin发酵培养基
• 3.2 单因素实验优化Nisin发酵条件
• 3.3 Nisin发酵罐中发酵工艺的研究
• 4 本章小结
• 第四章 Nisin下游提取工艺的研究
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要仪器
• 1.3 试剂
• 2 实验方法
• 2.1 发酵液的预处理
• 2.2 细胞吸附法
• 2.3 盐析法
• 2.4 超滤法提取Nisin
• 2.5 α-胰凝乳蛋白酶的水解实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 pH对Nisin吸附的影响
• 3.2 细胞吸附法提取Nisin
• 3.3 盐析法提取Nisin
• 3.4 正交实验最佳条件的验证
• 3.5 超滤法提取Nisin
• 3.6 α-胰凝乳蛋白酶的水解实验
• 4 本章小结
• 第五章 总结与展望
• 1 本实验的主要研究成果
• 2 后续研究展望
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表