基于单抗技术的三聚氰胺ELISA检测方法的建立

论文摘要

三聚氰胺（英文名：Melamine）是一种重要的三嗪类含氮杂环有机化工原料，广泛用于塑料、染料、化肥的生产和纺织行业。动物实验表明，长期摄入三聚氰胺可能会导致繁殖障碍、膀胱炎、慢性肾炎、肾结石、甚至膀胱癌。目前分析三聚氰胺最常用的是液相色谱法和液相色谱-质谱法联用法，但这些方法需要复杂的样品前处理过程、精密的分离检测仪器、良好的实验环境和专业操作人员，所以限制了这些方法的应用。相比之下，酶联免疫分析法（ELISA）具有样品前处理简单、灵敏度高、特异性强和成本低的优点，并能应用于现场检测。因此，开展三聚氰胺的ELISA方法的研究，具有重要的现实意义。围绕建立一个灵敏的三聚氰胺检测方法的目的，本研究制备了抗三聚氰胺的单抗和酶标抗原HRP-OVA-MEL并建立了直接和间接竞争ELISA方法。首先采用UV和SDS-PAGE法对免疫原三聚氰胺-BSA、包被原三聚氰胺-OVA进行鉴定。用三聚氰胺-BSA免疫BABL/c小鼠后，取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经筛选获得四株可分泌抗三聚氰胺抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为A85、B11、C4、B6。对单抗的部分免疫学特性进行分析。特异性鉴定结果表明，C4和B6单抗与载体蛋白OVA、BSA无特异性反应，而A85、B11单抗与载体蛋白存在交叉反应。亚类鉴定结果表明四株单抗均为IgM亚类。间接ELISA结果表明，四株单抗中C4株单克隆抗体的ELISA效价最高，腹水效价达到1：8000以上，亲和常数为2.92×108L·mol-1。分别用饱和硫酸铵纯法、PEG6000沉淀法、优球蛋白沉淀法纯化C4细胞株的腹水，结果显示PEG6000沉淀法纯化IgM抗体，耗时较少，得率和亲和力较高。其次，利用C4单克隆抗体建立了三聚氰胺间接竞争ELISA方法（ic-ELISA）。优化后的间接竞争ELISA反应条件为：4℃过夜包被抗原三聚氰胺-OVA，浓度为2.5μg/mL；5%甘氨酸37℃封闭1h；纯化后的抗体工作浓度为20μg/mL，37℃竞争反应1h；酶标二抗1：400037℃温育1h；底物作用20min。绘制的标准曲线中，其回归方程为y=-25.093x+62.409（R2=0.9877），IC50为3.12μg/L，线性范围在0.05-10μg/L之间。最后制备了酶标抗原HRP-OVA-MEL，并利用此酶标抗原建立了直接竞争ELISA法（dc-ELISA），绘制的曲线拟合方程为y=-11.432x+70.702（R2=0.9948），符合线性关系的判断标准。根据回归方程计算IC50约为56.88μg/L，线性范围0.1-1000μg/L。实验表明，本实验所制备的三聚氰胺单克隆抗体可用于检测三聚氰胺，为三聚氰胺酶联免疫快速检测试剂盒和免疫胶体金检测试纸条的开发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 插图和附表清单
• 本论文常用缩写词
• 文献综述
• 1 三聚氰胺免疫检测的研究意义
• 1.1 三聚氰胺的理化性质和用途
• 1.2 三聚氰胺的危害
• 1.3 三聚氰胺的检测方法
• 2 三聚氰胺免疫检测技术的基本原理
• 2.1 抗体技术的发展
• 2.2 抗原 -抗体的结合反应
• 2.3 抗原与小分子免疫
• 2.4 三聚氰胺免疫检测原理
• 2.5 免疫分析技术的发展
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 细胞系
• 1.1.3 主要试剂与器材
• 1.2 主要溶液配制
• 1.2.1 抗原鉴定溶液配制
• 1.2.2 细胞融合与培养常用试剂
• 1.2.3 ELISA 实验试剂
• 1.2.4 抗体纯化试剂
• 1.2.5 抗体浓度检测试剂
• 1.2.6 制备酶标记抗原试剂
• 1.2.7 三聚氰胺标准溶液
• 1.3 方法
• 1.3.1 人工抗原的鉴定
• 1.3.2 单克隆抗体的制备
• 1.3.3 单克隆抗体腹水的制备
• 1.3.4 单抗的部分免疫学特性鉴定
• 1.3.5 单克的纯化
• 1.3.6 间接竞争 ELISA 方法的建立和优化
• 1.3.7 酶标抗原的制备
• 1.3.8 酶标抗原的活性鉴定
• 1.3.9 直接竞争 ELISA 方法的建立
• 2 结果与分析
• 2.1 人工抗原鉴定
• 2.1.1 UV 鉴定
• 2.1.2 SDS-PAGE 鉴定
• 2.2 抗血清效价的测定
• 2.3 杂交瘤细胞株的建立
• 2.4 单克隆抗体的纯化
• 2.5 部分单抗生物学特性鉴定
• 2.5.1 单抗的 EL IS A 效价
• 2.5.2 单抗亚型鉴定
• 2.5.3 单抗特异性鉴定
• 2.5.4 C4 单抗分子量测定
• 2.5.5 C4 单抗亲和力测定
• 2.6 间接竞争 ELISA 方法的建立和优化
• 2.6.1 抗原抗体最适工作浓度的选择
• 2.6.2 包被条件的确定
• 2.6.3 封闭液的选择
• 2.6.4 封闭时间的确定
• 2.6.5 酶标二抗作用浓度的选择
• 2.6.6 酶标二抗作用时间的选择
• 2.6.7 底物作用时间的确定
• 2.6.8 间接竞争 ELISA 方法的建立
• 2.6.9 标准曲线
• 2.7 酶标抗原的鉴定
• 2.8 直接竞争 ELISA 方法的建立
• 2.8.1 抗原抗体最适工作浓度的选择
• 2.8.2 直接竞争 ELISA 方法的建立
• 2.8.3 标准曲线
• 3 讨论
• 3.1 抗原
• 3.2 杂交瘤细胞融合及培养
• 3.3 IgM 抗体的纯化
• 3.4 三聚氰胺单克隆抗体与载体蛋白的交叉反应
• 3.5 酶标抗原的制备
• 3.6 ELISA 实验的影响因素
• 3.7 直接和间接竞争 ELISA 法的比较
• 4 结论
• 4.1 人工抗原的鉴定
• 4.2 三聚氰胺单克隆抗体的制备和鉴定
• 4.3 三聚氰胺单克隆抗体的纯化
• 4.4 三聚氰胺间接竞争ELISA检测方法的建立
• 4.5 酶标抗原的制备和直接竞争ELISA方法的建立
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介