MACC1基因在肺癌组织及肺癌细胞系中的表达研究

论文摘要

目的:MACC1（metastasis-associated in colon cancer l,MACC1）基因是2009年发现的与结肠癌转移、侵袭相关的新基因。研究显示,MACC1基因作为肝细胞生长因子HGF/MET信号通路的一个关键的调节因子在结肠癌的侵袭和转移中发挥着重要作用,而且与预后呈负相关。MACC1可以与MET启动子结合,上调结肠癌中MET的表达,促进肿瘤细胞的运动和增殖;MACC1基因在HGF诱导的肿瘤转移、侵袭中亦发挥重要作用。作为一个新发现的基因,目前为止,MACC1表达水平与肺癌发生发展、侵袭和转移的关系尚不明确。因此,我们拟通过免疫组织化学染色和Western blot分别检测肺癌组织和肺癌细胞系中MACC1的表达。我们前期试验发现MACC1在肺癌细胞株SBC-5中高表达。因此拟通过构建MACC1基因特异性的真核表达干涉载体,转染肺癌细胞系SBC-5,筛选出MACC1基因表达下调明显的稳定转染细胞系。进而检测MACC1表达下调对肺癌细胞系SBC-5体外增殖活性、细胞迁移的影响,从而为MACC1分子成为肺癌治疗的新靶点提供实验性研究基础。方法:（1）采用免疫组织化学法检测63例肺组织（包括正常肺组织和肺腺癌组织）中MACC1蛋白的表达情况;Western blot法检测4种肺癌细胞系中MACC1蛋白表达。（2）设计并化学合成两对MACC1（metastasis-associated in colon cancer l,MACC1）基因特异的发夹结构小RNA,并且在BLAST中对靶序列进行同源性分析,退火后连接到pSilencer 4.1-CMV neo载体中,构建MACC1基因特异性真核表达干涉载体。通过限制性酶切及测序方法鉴定重组载体。将MACC1基因特异的干涉表达载体及无关干涉载体分别命名为MACC1/shRNA-1、MACC1/shRNA-2、MACC1/shRNA-NC。（3）分别将MACC1基因特异性的干涉表达载体及无关干涉对照载体经阳离子脂质体Lipofectamine TM 2000转染肺癌细胞系SBC-5细胞,经G418筛选两周后获得稳定转染的细胞。（4）通过RT-PCR和Western blot法分别检测转染后SBC-5细胞中MACC1mRNA和蛋白表达情况。（5）MTT法和克隆形成试验检测转染干涉载体组SBC-5细胞体外生长增殖状况;划痕试验观察转染干涉载体组SBC-5细胞迁移能力的变化。结果:（1）免疫组织化学结果显示,肺腺癌组织中MACC1蛋白表达阳性率为38.3%;MACC1蛋白在肺癌SBC-5细胞系中高表达,而在肺癌A549、PC14、SBC-3中几乎检测不到表达。（2）限制性酶切和测序方法鉴定结果证实,针对MACC1基因的真核表达干涉载体构建成功。（3）分别将MACC1/shRNA-1、MACC1/shRNA-2、MACC1/shRNA-NC经阳离子脂质体Lipofectamine TM 2000转染肺癌细胞系SBC-5,经G418筛选两周后得到稳定转染的细胞分别命名为SBC-5-S1、SBC-5-S2、SBC-5-NC。（4）同转染MACC1/shRNA-NC及未转染组细胞相比,稳定转染MACC1/shRNA-1的SBC-5-S1细胞中MACC1mRNA和蛋白表达水平分别抑制了约68.5%和58.5%,而在稳定转染MACC1/shRNA-2的SBC-5-S2细胞中则没有明显变化,故选择SBC-5-S1细胞用于下一步试验。（5）MTT和克隆形成试验结果显示,SBC-5-S1细胞的增殖活性明显降低（P<0.05）;划痕试验观察到SBC-5-S1细胞的增殖、迁移能力明显减弱。结论:MACC1基因的表达可能与肺腺癌的转移相关。我们成功构建了针对MACC1基因特异性真核表达干涉载体。体外实验显示,稳定转染MACC1/shRNA-1的SBC-5-S1细胞增殖、迁移能力明显下降。实验结果提示,MACC1有可能成为肺癌治疗的新靶点,从而为肺癌治疗新靶点的开发开辟新思路。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 第一部分 MACC1 基因的研究现状
• 第二部分 肿瘤转移研究进展
• 第三部分 肿瘤基因治疗研究进展
• 第四部分 RNA 干涉的研究现状
• 实验一 MACCI 基因在肺癌组织和肺癌细胞系中的表达
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 MACC1 基因特异siRNA 真核表达载体的构建
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 针对MACC1 基因的RNA 干涉载体转染人肺癌细胞系SBC-5后对SBC-5 细胞生物学行为的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢