论文题目: 纳他霉素高产菌株选育、发酵条件优化、发酵动力学及溶解度的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化工
作者: 骆健美
导师: 岑沛霖
关键词: 褐黄孢链霉菌,纳他霉素,菌种选育,发酵,优化,动力学模型,溶解度,提取纯化
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 纳他霉素（Natamycin）是一种二十六元多烯大环内酯类抗生素,由纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）、恰塔努加链霉菌（Streptomyces chatanoogensis）和褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）等经发酵生产,是一种高效、广谱的抗真菌抗生素。由于纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低,现已在食品、医疗等领域得到广泛应用。目前纳他霉素发酵的水平较低,导致成本高、应用前景受到限制。因此,对纳他霉素发酵进行深入的研究和开发具有重要意义。本文围绕如何提高抗真菌抗生素纳他霉素的产量和质量,对生产菌种的选育、发酵工艺、目标产物的溶解度、产品提取纯化等方面进行系统研究,获得了如下结果: 建立了测定S.gilvosporeus发酵液中纳他霉素含量的反相高效液相色谱法。该方法具有操作简单、快速灵敏、准确性好等优点,可作为纳他霉素的定量研究方法。 以褐黄孢链霉菌SG 1-4为出发菌株,经硫酸二乙酯和紫外线诱变处理,并选用2-脱氧-D-葡萄糖、乙酸钠、丙酸钠、硫酸链霉素作为抗性筛选剂,最终选育出一株高产纳他霉素的突变株SG 9-16,该菌株在未优化条件下的纳他霉素产量达到0.79 g/L,比出发菌株提高了150%。经验证,菌株SG 9-16的遗传性能十分稳定。 研究了菌株SG 9-16的摇瓶分批发酵条件。确定了最佳种子培养基组成及培养条件,并设计了较好的发酵培养基。考察了种龄、接种量、溶氧、发酵培养基初始pH、温度及前体对褐黄孢链霉菌发酵合成纳他霉素的影响,对发酵培养条件进行了优化。在最适发酵条件下,菌株SG 9-16摇瓶分批发酵生产纳他霉素的产量可达到3.0 g/L,比初始条件（0.79 g/L）的提高了280%。 利用5 L发酵罐进行纳他霉素的发酵放大研究,在优化条件下,发酵罐中的纳他霉素产量可达到2.86 g/L,比摇瓶分批发酵（不添加前体）提高了170.7%。以5 L发酵罐分批发酵的实验验数据为依据,对纳他霉素分批发酵动力学进行了研究,建立了形态-结构模型,该模型能较好地反映纳他霉素的分批发酵过程。同时,以模糊理论为基础计算得到褐黄孢链霉菌发酵生产纳他霉素过程的生长-生产耦合度为18.3%,是典型的生长-生产分离过程。 根据摇瓶分批发酵的初步研究结果,采用多元线性回归技术优化褐黄孢链霉菌发酵生产纳他霉素的过程。首先通过Plackett-Burman实验挑选出影响纳他霉素产量的关键因子为:初始pH、发酵温度、KH2PO4、CaCO3、酵母抽提物、蛋白胨和种龄,进而通过最陡爬坡路径逼近最大响应区域,再利用中心旋转组合实验拟合得到了响应曲面函数。由于该函数的驻点是鞍点,因此不具有全局的最大、最小值。最后通过约束优化得到较佳的实验点。 从已知的代谢途径着手,研究进一步提高纳他霉素产量的优化策略。结果表明,向发酵培养基中添加可降低细胞能荷水平的氰化物能有效提高发酵水平:向发酵培养基中加入能捕捉铵离子的磷酸镁有利于纳他霉素合成。优化后的发酵工艺条件为:发酵培养基:葡萄糖40 g/L;牛肉膏10 g/L,MgSO4·7H2O 1.0 g/L,NaCl 2g/L,黄豆饼粉15 g/L,淀粉30 g/L,KH2PO4 O g/L,CaCO3 2.4 g/L,酵母抽提物0.34 g/L,蛋白胨6.34 g/L,K4Fe
论文目录:
前言
第一章 文献综述
1．1 引言
1．2 纳他霉素概述
1．2．1 发现与命名
1．2．2 化学结构和理化性质
1．2．3 纳他霉素的抑菌作用
1．2．4 纳他霉素的特点
1．2．5 安全性研究
1．2．6 纳他霉素的应用情况
1．3 纳他霉素发酵研究进展
1．3．1 纳他霉素产生菌菌株特征
1．3．2 纳他霉素发酵工艺研究进展
1．3．3 基因工程改造纳他霉素产生菌的研究进展
1．3．4 纳他霉素分离提取概况
1．3．5 纳他霉素检测方法概述
1．4 菌种选育策略
1．4．1 诱变育种背景
1．4．2 突变株的筛选
1．5 微生物发酵工艺的优化策略
1．5．1 统计试验设计
1．5．2 添加前体的策略
1．6 本文研究目标和思路
第二章 实验材料与方法
2．1 实验材料
2．1．1 菌种
2．1．2 培养基
2．1．3 主要药品和试剂
2．1．4 主要实验设备和仪器
2．1．5 相关溶液配制
2．2 培养条件
2．2．1 斜面培养
2．2．2 单菌落分离平板培养
2．2．3 种子培养
2．2．4 发酵培养
2．3 实验方法
2．3．1 菌种活化
2．3．2 菌种保藏
2．3．3 孢子悬浮液的制备和计数
2．3．4 存活率的测定
2．3．5 pH值的测定
2．3．6 菌丝体干重(DCW)的测定
2．3．7 糖的测定
2．3．8 可溶性氨基氮的测定
2．3．9 ATP含量的测定
2．3．10 丙酮酸含量的测定
2．3．11 溶磷(无机磷)含量的测定
2．3．12 铵离子的测定
2．4 纳他霉素的分析方法
2．4．1 色谱分析条件
2．4．2 样品溶液制备
2．4．3 检测波长的确定
2．4．4 流动相和流速的确定
2．4．5 HPLC分析纳他霉素的标准曲线
2．4．6 最小检测限
2．4．7 精确性和准确性实验
2．4．8 发酵液样品测定
2．4．9 讨论
第三章 纳他霉素高产菌株的诱变育种和筛选
3．1 引言
3．2 材料与方法
3．3 纳他霉素生产菌株的诱变育种
3．3．1 出发菌株的选择与纯化
3．3．2 菌种的诱变处理
3．3．3 去代谢调节突变株的筛选
3．4 实验结果和讨论
3．4．1 快速、有效初筛方法的确定
3．4．2 出发菌株生产纳他霉素性能的测定
3．4．3 诱变剂量的确定
3．4．4 各种抗性突变株的筛选
3．4．5 菌株稳定性测定
3．5 小结
第四章 纳他霉素发酵条件的初步研究
4．1 引言
4．2 材料与方法
4．3 结果和讨论
4．3．1 孢子质量对发酵的影响
4．3．2 种子培养基的确定
4．3．3 发酵培养基的初步筛选
4．3．4 发酵时间的确定
4．3．5 培养条件对纳他霉素产量的影响
4．3．6 前体对纳他霉素产量的影响
4．4 小结
第五章 纳他霉素的发酵放大及其动力学研究
5．1 引言
5．2 材料与方法
5．2．1 菌种
5．2．2 培养基
5．2．3 培养条件
5．2．4 分析方法
5．2．5 实验仪器
5．3 结果与讨论
5．3．1 纳他霉素发酵放大的摇瓶准备实验
5．3．2 5L发酵罐分批发酵工艺参数的控制
5．3．3 5L发酵罐间歇补料分批发酵
5．4 纳他霉素发酵动力学的研究
5．4．1 基于形态学结构模型的发酵动力学研究
5．4．2 基于模糊理论的发酵动力学研究
5．4．3 利用模糊理论定量化研究发酵过程细胞生长和产物合成的关系
5．5 本章小结
第六章 纳他霉素发酵条件的优化研究
6．1 引言
6．2 响应面法优化纳他霉素发酵条件的研究
6．2．1 引言
6．2．2 材料和方法
6．2．3 结果与讨论
6．2．4 小结
6．3 基于纳他霉素生物合成途径的优化研究
6．3．1 引言
6．3．2 材料和方法
6．3．3 研究思路的确定
6．3．4 结果和讨论
6．4 本章小结
第七章 纳他霉素溶解度的测定与关联
7．1 引言
7．2 材料与方法
7．2．1 实验试剂
7．2．2 实验设备
7．2．3 纳他霉素溶解度的测定
7．2．4 分析方法
7．2．5 模型计算
7．3 结果和讨论
7．3．1 可靠性实验
7．3．2 不同温度下纳他霉素的溶解度
7．3．3 不同溶剂配比下的纳他霉素的溶解度
7．3．4 溶液pH值的影响
7．3．5 盐离子的影响
7．4 小结
第八章 纳他霉素的提取纯化及结构鉴定
8．1 引言
8．2 材料与方法
8．2．1 实验试剂
8．2．2 实验设备
8．2．3 实验方法
8．3 结果与讨论
8．3．1 发酵液的预处理
8．3．2 纳他霉素的提取实验
8．3．3 分离产品的化学分析和结构鉴定
8．4 本章小结
第九章 结论与展望
9．1 结论
9．2 展望
符号说明
参考文献
附录
博士期间发表论文
致谢
独创性声明
发布时间: 2006-05-10
参考文献
- [1].多烯大环抗真菌剂纳他霉素的研究[D]. 李东.天津科技大学2005
- [2].纳他霉素高产菌株空间育种、工艺优化及工业放大研究[D]. 梁景乐.浙江大学2007
- [3].恰塔努加链霉菌纳他霉素高效生物合成的分子机制[D]. 刘水平.浙江大学2015
相关论文
- [1].纳他霉素产生菌诱变、种内原生质体融合及发酵条件研究[D]. 郑凤娥.沈阳农业大学2008
- [2].酒精浓醪发酵菌种选育及发酵条件的优化[D]. 黄宇彤.天津科技大学2002
- [3].L-缬氨酸高产菌的选育及其发酵条件研究[D]. 赵丽丽.天津科技大学2004
- [4].丁酸梭菌培养与发酵动力学以及调节腹泻小鼠肠道菌群平衡的研究[D]. 孔青.浙江大学2006
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