南极普里兹湾深海沉积物微生物低温酶的筛选、基因克隆表达及性质分析

论文摘要

南极、深海等极端环境中蕴藏着丰富的资源，其中微生物资源是国内外研究的热点。它们经过长期的进化、选择，在各种极端的环境条件下形成了独特的组织结构、酶系统及代谢机制以进行生存和繁衍。对低温酶、冷适应酶独特的生理结构及机能进行研究，探讨生物适应特殊的生存环境而发生的基因变异，无论在科学上还是实际开发应用上都具有重大的意义。由于极端环境样品采集方面的限制，目前大部分的极端微生物仍未得到认识和研究。低温酶由于在低温下的高催化效率，而在工业、农业、医药卫生、洗涤、生物制剂、食品等方面都有极其广泛的应用，其中淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和纤维素酶等是主要酶制剂品种。本文对南极普里兹湾深海沉积物（PN5-6，74°25’E，66°55’S，900m）样品开展研究。采用传统分离微生物手段获得可培养的微生物共42株，对它们进行选择性培养，筛到17株细菌明显具有分泌水解酶的能力，其中淀粉酶产生菌6株，分别有假单胞菌、红球菌、诺卡氏菌；脂肪酶产生菌8株，分别有假单胞菌和嗜冷杆菌；蛋白酶产生菌1株，为诺卡氏菌。对这17株菌的16S rDNA进行进化树分析，12株细菌属于γ-Proteobacteria亚群，有5株细菌属于革兰氏阳性细菌。复合酶产生菌7197的产酶发酵条件得到优化；诺卡氏菌7326产的淀粉酶得到了纯化和性质分析；来自嗜冷杆菌7195的低温脂肪酶基因（lipAl）得到了克隆与表达；来自假单胞菌7323的低温脂肪酶（lipA）得到了克隆与表达；来自假单胞菌7197的淀粉酶基因（amyP）得到了克隆与表达，这些表达后的蛋白均得到纯化和性质的分析。此外，采用宏基因组技术，提取该沉积物样品的宏基因组DNA，通过设计探针从中克隆到低温脂肪酶基因（lip3）的开放阅读框完整序列，构建重组表达载体，在大肠杆菌中获得表达，表达后的重组蛋白也得到了纯化和性质分析。该研究结果及其所建立的技术为南极丰富的低温酶资源的研究开发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 南极、深海生态学研究简介
• 1.1.1 南极概况
• 1.1.2 深海环境简介
• 1.1.3 南极微生物学研究进展
• 1.1.4 南极普里兹湾生态环境研究进展
• 1.2 极端生物和极端酶
• 1.2.1 低温微生物
• 1.2.2 嗜热微生物
• 1.2.3 嗜酸、嗜碱微生物
• 1.2.4 嗜盐微生物
• 1.2.5 其他极端微生物
• 1.3 低温微生物和低温酶
• 1.3.1 低温微生物的生态分布
• 1.3.2 低温微生物和低温酶的应用及前景
• 1.4 微生物淀粉酶研究简介
• 1.4.1 微生物α-淀粉酶
• 1.4.2 α—淀粉酶分子生物学
• 1.4.3 原生质体融合和诱变
• 1.4.4 基因克隆及氨基酸序列
• 1.4.5 淀粉酶的生产
• 1.4.6 α-淀粉酶纯化和酶的特性
• 1.5 微生物脂肪酶的研究进展
• 1.5.1 微生物脂肪酶的研究进展
• 1.5.2 微生物脂肪酶及其筛选方法
• 1.5.3 微生物脂肪酶的发酵生产
• 1.5.4 微生物脂肪酶在食品工业中的应用
• 1.5.4.1 油脂的改性
• 1.5.4.2 脂肪酶在乳制品中的应用
• 1.5.4.3 脂肪酶在面类食品加工中的应用
• 1.5.4.4 脂肪酶在其他食品工业中的应用
• 1.5.4.5 其他应用
• 1.6 微生物酶的发酵和产量的提高
• 1.6.1 培养基
• 1.6.2 产酶微生物的要求
• 1.6.3 发酵生产
• 1.7 酶的纯化
• 1.8 克隆与低温酶的大量表达
• 1.9 蛋白质工程:稳定性和催化能力的提高
• 1.10 酶的定点突变
• 1.11 酯酶和脂肪酶的高通量筛选方法（High Through—put Screening,HTS）
• 1.12 新型酶的发现
• 1.13 分子生物学技术在微生物多样性和生物活性物质研究中的应用
• 1.13.1 从自然样品中直接提取核酸
• 1.13.2 聚合酶链式反应法（PCR）
• 1.13.3 克隆基因文库分析法
• 1.13.4 宏基因组文库构建
• 1.13.5 宏基因组文库的筛选
• 1.14 本论文研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品采集与前处理
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 工具酶
• 2.1.5 其他试剂
• 2.1.6 常用溶液、培养基的配制
• 2.1.7 主要仪器
• 2.1.8 主要分析软件
• 2.2 方法
• 2.2.1 基本方法
• 2.2.1.1 感受态细胞的制备
• 2.2.1.2 质粒的转化
• 2.2.1.3 质粒提取
• 2.2.1.4 酶切反应
• 2.2.1.5 从凝胶上回收DNA
• 2.2.1.6 DNA沉淀
• 2.2.1.7 细菌染色体DNA的提取
• 2.2.1.8 沉积物中总DNA的提取与纯化
• 2.2.1.9 沉积物中粗提DNA的纯化
• 2.2.1.10 双链DNA补齐与磷酸化
• 2.2.1.11 质粒去磷酸化
• 2.2.1.12 连接反应
• 2.2.1.13 （化学转化）感受态细胞的制备
• 2.2.1.14 质粒的化学转化
• 2.2.1.15 PCR反应
• 2.2.1.16 菌落PCR
• 2.2.1.17 蛋白质透析除盐及浓缩
• 2.2.1.18 碱性淀粉酶、脂肪酶的分离纯化
• 2.2.1.18.1 硫酸铵分级沉淀预实验
• 2.2.1.18.2 硫酸铵沉淀
• 2.2.1.18.3 脱盐
• 2.2.1.18.4 离子交换层析中溶液pH值的选择
• 2.2.1.18.5 离子交换层析
• 2.2.1.18.6 分子筛层析
• 2.2.1.19 重组淀粉酶、脂肪酶的诱导表达及纯化
• 2.2.1.20 蛋白质浓度的测定
• 2.2.1.21 SDS-PAGE
• 2.2.1.22 氢氧化钠直接滴定法测定脂肪酶活力
• 2.2.1.23 pNPP法测定脂肪酶活力
• 2.2.1.24 SKB法测定淀粉酶活力
• 2.2.1.25 α-淀粉酶活测定
• 2.2.1.26 DNS法测定淀粉酶活力
• 2.2.1.27 淀粉酶酶谱分析（活性染色）
• 2.2.1.28 薄层层析分析酶解产物
• 2.2.1.29 核酸测序及序列分析
• 2.2.1.30 16Sr DNA的鉴定与系统发育树的构建
• 2.2.2 普里兹湾深海沉积物淀粉酶和脂肪酶等水解酶类多样性分析
• 2.2.2.1 样品的采集和前处理
• 2.2.2.2 菌种分离和筛选
• 2.2.2.3 菌种鉴定（BIOLOG Micro Station）
• 2.2.2.4 细菌的DAPI和AO双染色计数
• 2.2.3 南极低温淀粉酶产生菌的分类鉴定及其发酵条件和酶学性质研究
• 2.2.3.1 培养基及培养方法
• 2.2.3.2 菌种分离与鉴定
• 2.2.3.3 温度对菌株7197生长的影响
• 2.2.3.4 发酵条件研究
• 2.2.3.5 粗酶液制备及初步纯化
• 2.2.3.6 淀粉酶酶活测定
• 2.2.3.7 脂肪酶酶活测定
• 2.2.3.8 酶的基本特征
• 2.2.4 7197淀粉酶基因的克隆及测序
• 2.2.4.1 第一轮简并引物PCR反应
• 2.2.4.2 第二轮巢式PCR反应
• 2.2.4.3 第三轮再做引物PCR反应
• 2.2.4.4 第四轮PCR扩增全长基因amyP重组表达载体并测序
• 2.2.5 7323脂肪酶基因的克隆及测序、表达载体构建
• 2.2.5.1 pT-16srDNA载体构建
• 2.2.5.2 脂肪酶lipA基因的PCR扩增和pT-lipA质粒的构建
• 2.2.5.3 重组表达载体pLLP-OmpA-lipA的构建
• 2.2.5.4 脂肪酶LipA的诱导表达与纯化
• 2.2.5.4.1 脂肪酶LipA的诱导表达
• 2.2.5.4.2 非变性条件下表达酶LipA的纯化
• 2.2.6 南极普里兹湾深海沉积物宏基因组DNA低温脂肪酶的PCR克隆
• 2.2.6.1 样品的采集和前处理
• 2.2.6.2 沉积物总DNA的提取
• 2.2.6.3 脂肪酶基因的PCR克隆
• 2.2.6.4 表达载体的构建pLLP-lip3的构建
• 2.2.6.5 脂肪酶的诱导表达
• 2.2.6.6 脂肪酶的纯化
• 2.2.6.7 脂肪酶酶活力测定
• 2.2.6.8 温度对酶活力及稳定性的影响测定
• 2.2.6.9 pH值对酶活力及稳定性的影响
• 2.2.6.10 温度对酶促反应的影响
• 2.2.6.11 核酸测序及同源性分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 南极普里兹湾深海（PN5-6）站位微生物淀粉酶的多样性调查
• 3.1.1 深海沉积物中微生物的分离
• 3.1.2 低温淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等产生菌的筛选
• 3.1.3 PN5-6沉积物中细菌多样性分布及系统发育分析
• 3.1.4 低温淀粉酶产生菌的生理鉴定
• 3.1.5 高淀粉酶活性菌株7193和7197的酶谱分析
• 3.2 7197淀粉酶产生菌的研究
• 3.2.1 深海沉积物中产淀粉酶菌株7197的分离鉴定
• 3.2.2 7197菌株的形态特征
• 3.2.3 7197菌株的生理生化特性
• 3.2.4 7197菌株16S rDNA序列分析结果
• 3.2.5 7197菌株系统发育分析
• 3.2.6 产酶培养基的优化
• 3.2.6.1 不同的有机碳源对产酶的影响
• 3.2.6.2 不同的氮源对产酶的影响
• 3.2.6.3 不同无机盐对产酶的影响
• 3.2.7 发酵条件的优化
• 3.2.7.1 培养温度对产酶的影响
• 3.2.7.2 培养时间对产酶的影响
• 3.2.7.3 接种量对产酶的影响
• 3.2.7.4 起始pH值对产酶的影响
• 3.2.8 产酶条件试验
• 3.2.9 低温脂肪酶和淀粉酶的分离纯化
• 3.2.10 低温复合酶的酶学性质研究
• 3.2.10.1 温度对复合酶活性的影响
• 3.2.10.2 复合酶的热稳定性
• 3.2.10.3 pH对脂肪酶活性的影响
• 3.2.10.4 表面活性剂对脂肪酶活力的影响
• 3.2.10.5 金属离子及螯合剂对脂肪酶活力的影响
• 3.2.11 讨论
• 3.3 Pseudomonas sp.7197淀粉酶基因的克隆和表达
• 3.3.1 Pseudomonas sp.7197基因组DNA的提取
• 3.3.2 Pseudomonas sp.7197淀粉酶基因的克隆和测序
• 3.3.2.1 Pseudomonas sp.7197淀粉酶基因的保守区域的克隆和测序
• 3.3.2.2 巢式PCR克隆7197淀粉酶保守区域两段的序列
• 3.3.2.3 Pseudomonas sp.7197淀粉酶各片段基因克隆结果分析
• 3.3.2.4 Pseudomonas sp.7197淀粉酶基因全长的克隆和测序
• 3.3.3 序列同源比对分析
• 3.3.4 Pseudomonas sp.7197淀粉酶amyP基因重组表达载体的构建和表达
• 3.3.5 纯酶性质:纯化AmyP的最适温度曲线
• 3.3.6 薄层层析（TLC）分析酶解产物
• 3.4 Pseudomonas sp.7323脂肪酶基因lipA的克隆和表达
• 3.4.1 Pseudomonas sp.7323脂肪酶基因lipA全长的克隆
• 3.4.2 氨基序列分析和结构预测
• 3.4.3 Pseudomonas sp.7323脂肪酶lipA基因重组表达载体的构建和表达
• 3.4.4 纯化的表达型rLipA和野生型wLipA的最适作用温度和pH
• 3.4.5 金属离子及螯合剂对脂肪酶活力的影响
• 3.4.6 表面活性剂对脂肪酶活力的影响
• 3.4.7 脂肪酶对各种底物的特异性
• 3.4.8 讨论
• 3.5 南极深海沉积物宏基因组低温脂肪酶基因的PCR克隆与表达及纯化性质
• 3.5.1 DNA提取结果
• 3.5.2 脂肪酶基因（lip3）的克隆和测序
• 3.5.3 序列分析
• 3.5.4 脂肪酶基因在大肠杆菌中的表达及产物纯化
• 3.5.5 纯酶性质
• 3.5.5.1 温度对酶活力及稳定性的影响
• 3.5.5.2 pH值对酶活力及稳定性的影响
• 3.5.5.3 温度对酶促反应的影响
• 3.5.6 讨论
• 4 总结与展望
• 5 参考文献
• 附录一.EMBL数据库收录号
• 附录二.攻读硕士期间发表论文
• 发表和接受发表的文章
• 学术研讨会文章
• 获得学术奖励情况
• 致谢