人工合成Protein A仿生分子的初步研究

论文摘要

随着基因组学和蛋白组学的研究进展,模拟活性蛋白合成仿生分子的研究越来越引起人们的关注。人们希望利用仿生分子体外模拟生物体内蛋白间的相互作用,使其在生物分离、医药等领域发挥越来越大的作用。本论文旨在探索一种新的仿生分子合成方法。主要是模拟Protein A与IgG间的相互作用,将计算机辅助药物分子设计与异位合成方法相结合,合成Protein A仿生分子,并利用亲和色谱技术评价其选择性及其与IgG等蛋白间的相互作用力。实验结果表明:（1）将计算机辅助药物分子设计方法应用到模拟配基的筛选中,得到了一个模拟配基数据库,其中的小分子已按与IgG活性位点作用力的大小进行了排序;（2）利用定向固定化IgG的Fc片段实验筛选模拟配基数据库中的可溶性分子,利用固定化小分子配基实验研究非水溶性小分子与IgG间的相互作用,从中筛选出了与IgG具有较强作用力的小分子配基N-苄氧羰基-L-酪氨酸（N-cbz-L-Tyr）;（3）将该配基固定在琼脂糖凝胶上,合成了固定化N-cbz-L-Tyr亲和层析介质,并对其进行了详细的色谱评价。该介质对IgG有一定的选择性,可以从血浆中分离纯化得到IgG,IgG在总蛋白中所占的质量百分比为31.2%;（4）通过一个枝状分子甘氨酸-L-谷氨酰胺（Gly-L-Gln）,将IgG的两个模拟配基N-cbz-L-Tyr和N-苄氧羰基-L-天冬氨酸（N-cbz-L-Asp）偶联合成了一个枝状亲和配基,在实验技能上实现了简单枝状分子的异位合成（蛋白A仿生分子）。对以该仿生分子为配基的亲和层析材料作色谱评价,该材料可以从血浆中分离纯化得到IgG,IgG在吸附的总蛋白中所占的质量百分比约为77.7%,这说明在模拟Protein A活性位点的结构基础上,异位合成的仿生配基在对IgG的选择性上有了较大提高。因此,计算机辅助药物分子设计与固定化受体和配基实验相结合筛选模拟配基方法的建立及异位合成仿生分子技术的创新,共同开辟了一条快速效筛选模拟配基、进而合成高选择性仿生分子的新途径。

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摘要

ABSTRACT

引言

1 文献综述

1.1 亲和模拟配基筛选

1.1.1 引言

1.1.2.利用组合库筛选短肽分子作为亲和配基

1.1.3.基于受体高级结构的人工仿生配体设计

1.2 分子印迹研究进展

1.2.1 引言

1.2.2 包埋法

1.2.3 界面印迹

2 亲和模拟配基的筛选方法及结果

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 药品

2.2.2 仪器

2.2.3 数据库及软件

2.3 实验方法

2.3.1 各种蛋白的定量定性分析方法

2.3.2 Protein A亲和层析柱的制备

2.3.3 各种配基的定量方法

2.4 配基筛选过程及结果

2.4.1 计算机筛选模拟配基

2.4.2 定向固定化Fc片段进一步筛选配基

2.5 小结

3 基于N-CBZ-L-TYR配基的亲和色谱及其性能评价

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 药品

3.2.2 仪器

3.3 实验方法

3.3.1 固定化N-cbz-L-Tyr亲和层析材料合成

3.3.2 N-cbz-L-Tyr键合量的检测

3.3.3 固定化N-cbz-L-Tyr亲和层析材料纯化血浆蛋白质条件优化

3.3.4 固定化N-cbz-L-Tyr亲和层析材料色谱性能评价

3.3.5 固定化N-cbz-L-Tyr亲和层析材料对HSA，IgG的静态吸附和洗脱效果

3.3.6 固定化N-cbz-L-Tyr亲和层析材料的重复使用性

3.4 结果与讨论

3.4.1 计算机模拟Fc片段与N-cbz-L-Tyr的作用效果

3.4.2 固定化N-cbz-L-Tyr亲和层析材料合成

3.4.3 固定化N-cbz-L-Tyr亲和层析材料对血浆蛋白质的分离纯化

3.4.4 固定化N-cbz-L-Tyr亲和层析材料色谱性能评价

3.4.5 固定化N-cbz-L-Tyr亲和层析材料对HSA，IgG的静态吸附及洗脱效果

3.4.6 固定化N-cbz-L-Tyr亲和层析材料的重复使用性

3.5 小结

4 亲水基团修饰N-CBZ-L-TYR配基的亲和层析材料及其性能评价

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 药品

4.2.2 仪器

4.3 实验方法

4.3.1 亲水基团修饰的N-cbz-L-Tyr亲和层析材料的合成

4.3.2 亲水基团修饰的N-cbz-L-Tyr亲和层析材料对HSA、IgG的静态吸附及洗脱效果

4.3.3 亲水基团修饰的N-cbz-L-Tyr亲和层析材料色谱性能评价

4.3.4 对血浆蛋白的分离纯化

4.4 结果与讨论

4.4.1 亲水基团修饰的N-cbz-L-Tyr亲和层析材料对HSA，IgG的静态吸附及洗脱效果

4.4.2 亲水基团修饰的N-cbz-L-Tyr亲和层析材料的色谱性能评价

4.4.3 亲水基团修饰的N-cbz-L-Tyr亲和层析材料纯化血浆蛋白质

4.5 小结

5 异位合成PROTEIN A仿生配基的亲和层析材料及其性能评价

5.1 引言

5.2 实验材料

5.2.1 药品

5.2.2 仪器

5.3 实验方法

5.3.1 Protein A仿生配基的异位合成

5.3.2 异位合成Protein A仿生配基亲和层析材料纯化血浆蛋白质

5.3.3 异位合成Protein A仿生配基亲和层析材料色谱性能评价

5.3.4 异位合成Protein A仿生配基亲和层析材料对HSA，IgG的静态吸附及洗脱效果

5.3.5 异位合成Protein A仿生配基的重复使用性

5.4 结果与讨论

5.4.1 计算机模拟Fc片段与N-cbz-L-Tyr和N-cbz-L-Asp的作用效果

5.4.2 异位合成Protein A仿生配基亲和层析材料纯化血浆蛋白质

5.4.3 异位合成Protein A仿生配基亲和层析材料色谱性能评价

5.4.4 异位合成Protein A仿生配基亲和层析材料对HSA，IgG的静态吸附及洗脱效果

5.4.5 异位合成Protein A仿生配基亲和层析材料的重复使用性能

5.5 三种材料性能纵向比较与讨论

5.6 小结

6 结论与展望

6.1 主要结论

6.2 特色与创新点

6.3 展望

参考文献

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致谢

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