罗非鱼海豚链球菌疫苗的研制及免疫效果的初步研究

论文摘要

海豚链球菌(Streptococcus iniae)病是水生动物的一种重要细菌性疾病,可感染多种海水和淡水鱼类,在世界许多国家均有该病的暴发和流行,对渔业生产造成巨大危害。该病主要集中在地中海、中亚、东南亚和澳大利亚等地区,近年来我国海豚链球菌病暴发呈上升趋势。海豚链球菌不仅是引起鱼类链球菌病的主要病原,而且对食品安全和人类健康构成了威胁,该菌可引发人类蜂窝织炎、心内膜炎、关节炎、脑膜炎、脊髓炎等。该病目前主要靠用化学药物进行防治,但化学疗法有很多弊端,相比而言疫苗接种对养殖环境和人类健康是安全的,因此被认为是防治细菌性疾病的最重要的方法之一。目前国外已有很多学者已开展了海豚链球菌疫苗的研究和探索并取得了一定成效,但国内尚未见疫苗研究的相关报道。广西是罗非鱼养殖的主要地区之一,鱼类链球菌病造成的经济损失和随之带来的药物残留及环境污染已严重影响广西罗非鱼养殖业的健康发展。本研究从广西各地发病的罗非鱼体内分离出了9株链球菌,采用传统方法和分子生物学方法相结合的手段对分离的致病性菌株进行了详细鉴定,最终确定8株为为海豚链球菌,证明海豚链球菌是广西罗非鱼链球菌病的主要病原;选取3株具有区域代表性的菌株对罗非鱼先后进行不同剂量的两次攻毒试验,选择具有较好免疫原性和交叉免疫保护力的菌株做为疫苗候选菌株,并采用福尔马林常规灭活的方法制备了灭活疫苗。本研究对研制的灭活疫苗进行了罗非鱼免疫后的免疫应答和保护效果的初步研究。通过不同免疫途径(注射、浸泡、口服)和免疫剂量对罗非鱼进行免疫效果试验;并在免疫前和免疫后的不同时间里对试验鱼进行尾静脉采血,通过测定血液中白细胞的数量、各类白细胞的含量及其吞噬活性,血清的抗菌活力、溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活力及抗体水平。实验证明经过疫苗免疫的罗非鱼对致病性海豚链球菌的抵抗力明显增强,具有很高的相对保护率,注射组的相对保护率高达90%以上;研究结果还表明,疫苗免疫后白细胞总数、淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞数量均显著高于对照组(P＜0.05),血细胞的吞噬活性明显增强。血清的抗菌活力、溶菌酶活性和抗体水平与对照组差异显著(P＜0.05),其中注射免疫组罗非鱼的免疫能力提高最明显,浸泡和口服免疫的罗非鱼其免疫能力也有不同程度的提高。研究结果证明本研究制备的罗非鱼海豚链球菌疫苗是有效的,可以通过合适的免疫途径对罗非鱼进行免疫接种海豚链球菌疫苗来预防该病的感染和暴发。本研究还对罗非鱼的血清免疫球蛋白(immunoglobulin)进行了纯化和初步分析,确定了罗非鱼血清免疫球蛋白的分子量,为罗非鱼免疫球蛋白结构的进一步研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 一、鱼类链球菌病研究进展
• 1 病原
• 2 形态特征
• 3 流行病学
• 4 症状和病理变化
• 5 致病机理
• 6 诊断方法
• 6.1 常规诊断方法
• 6.2 自动化检测技术
• 6.3 分子生物学鉴定
• 7 疫苗的研究现状
• 二、鱼类疫苗研究的现状
• 1 鱼类疫苗的发展历程
• 1.1 试验探索期
• 1.2 生产应用期
• 1.3 攀登发展期
• 2 疫苗的种类
• 2.1 灭活疫苗
• 2.2 活疫苗
• 2.3 亚单位疫苗
• 2.4 化学疫苗
• 2.5 基因工程疫苗
• 2.6 合成肽疫苗
• 2.7 DNA疫苗
• 3 疫苗的接种途径
• 3.1 单一给予方式
• 3.2 混合给予方式
• 3.3 多次给予方式
• 4 疫苗免疫效果评价
• 4.1 特异性免疫水平的检测
• 4.2 非特异性免疫水平的检测
• 4.3 免疫保护率（RPS）
• 4.4 免疫保护指数（PI）
• 5 鱼用疫苗发展的前景及存在的问题
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 研究一 广西罗非鱼链球菌流行菌株的分离鉴定
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 溶液的配制
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 采样及细菌培养
• 2.2 细菌的纯化
• 2.3 革兰氏染色
• 2.4 生化鉴定
• 2.5 特异性PCR鉴定
• 3 结果
• 3.1 分离培养与染色结果
• 3.2 生化鉴定结果
• 3.3 PCR鉴定结果
• 4 讨论
• 研究二 疫苗候选菌株的筛选和疫苗制备
• 1 材料
• 1.1 试验鱼以及饲养管理
• 1.2 候选菌株
• 1.3 主要试剂
• 1.4 培养基的配制
• 1.5 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 细菌扩大培养
• 2.2 耐受试验
• 2.3 二次攻毒试验
• 2.4 候选菌株半数致死量测定
• 2.5 候选菌株灭活条件的研究
• 2.6 疫苗的制备
• 3 结果
• 3.1 耐受试验和攻毒试验结果
• 3.2 S005菌株半数致死量测定
• 3.3 福尔马林对S005灭活试验的结果
• 3.4 安全性检测结果
• 4 讨论
• 研究三 罗非鱼对海豚链球菌疫苗产生免疫应答和保护效果的研究
• 一、水族箱饲养条件下海豚链球菌疫苗对罗非鱼免疫效果的研究
• 1 材料
• 1.1 试验动物及日常饲养管理
• 1.2 海豚链球菌灭活疫苗
• 1.3 金黄色葡萄球菌悬液
• 1.4 抗菌活力测定菌液
• 1.5 ELISA包被抗原
• 1.6 主要试剂
• 1.7 ELISA检测所用溶液的配制
• 1.8 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 试验分组与处理
• 2.2 WBC和DLC的测定
• 2.3 吞噬活性检测
• 2.4 血清抗菌活力（Ua）
• 2.5 血清溶菌酶活性（UI）
• 2.6 血清抗体水平
• 2.7 攻毒实验
• 2.8 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 WBC和DLC的检测结果
• 3.2 吞噬活性检测结果
• 3.3 血清抗菌活力（Ua）
• 3.4 血清溶菌酶活性（UI）
• 3.5 血清抗体水平
• 3.6 疫苗的保护效果
• 二、池塘小网箱饲养条件下海豚链球菌疫苗对罗非鱼免疫效果的研究
• 1 材料
• 1.1 试验动物及日常饲养管理
• 2 方法
• 2.1 试验分组与处理
• 2.2 超氧化物歧化酶（SOD）活力
• 3 结果
• 3.1 WBC和DLC的检测结果
• 3.2 吞噬活性检测结果
• 3.3 血清抗菌活力（Ua）
• 3.4 血清溶菌酶活性（UI）
• 3.5 超氧化物歧化酶（SOD）活力
• 3.6 血清抗体水平
• 3.7 疫苗的保护效果
• 三、网箱小试的免疫保护效果
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 四、讨论
• 4.1 疫苗免疫对罗非鱼细胞免疫功能的影响
• 4.2 疫苗免疫对罗非鱼体液免疫功能的影响
• 4.3 疫苗免疫对罗非鱼非特异免疫功能的影响
• 4.4 疫苗免疫对罗非鱼抗病能力的影响
• 4.5 不同免疫途径对罗非鱼免疫功能的影响
• 研究四 罗非鱼血清免疫球蛋白的纯化及分子量的初步分析
• 1 材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 试剂
• 1.3 SDS-PAGE试剂的配制
• 1.4 Western-blot试剂的配制
• 1.5 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 血清制备
• 2.2 饱和硫酸铵分步盐析
• 2.3 Sephadex G-200柱层析
• 2.4 Ig纯化效果的检测
• 2.5 兔抗罗非鱼Ig多克隆抗体的制备
• 2.6 鲟鱼血清Ig的免疫印迹鉴定
• 3 结果
• 3.1 两种提取方法的SDS-PAGE检测结果
• 3.2 兔抗罗非鱼Ig血清效价ELISA结果
• 3.3 罗非鱼纯化血清Ig结构的初步分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 结论
• 附图
• 1. 罗非鱼发病的病理症状
• 2. 罗非鱼血细胞图片
• 致谢
• 个人简历
• 攻读硕士期间发表的学术论文、获奖及参加的学术活动情况