一、用Bacillus subtilis NX-2菌株谷氨酰转肽酶催化合成S-苄基-谷胱甘肽（论文文献综述）
熊爱英[1]（2016）在《C.glutamicum γ-谷氨酰转肽酶的重组表达、酶学性质及其在谷氨酸发酵中应用的研究》文中进行了进一步梳理γ-谷氨酰转肽酶（GGT）是广泛分布于动植物及微生物体内的特异酶,能专一性催化y-谷氨酰基化合物中的γ-谷氨酰键断裂,释放出谷氨酸,表现为水解作用;同时也能将y-谷氨酰基转移到氨基酸及小肽上,生成新的γ-谷氨酰化合物,表现为转肽作用。基于其双重催化特性,γ-谷氨酰转肽酶具有非常广阔的工业应用前景。目前,国内外对GGT的研究主要集中在各种γ-谷氨酰化合物的合成。然而,对于利用该酶制备谷氨酸却鲜有研究。目的本研究以谷氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌的模式菌-C.glutamicum ATCC 13032的GGT（CgGT）为研究对象,对该酶的重组表达、酶学性质、结构基础及其在C.glutam icum发酵谷氨酸中的应用进行了系统的研究,旨在为今后进一步利用其工业化发酵谷氨酸奠定基础,同时也为其更深一步的分子学研究提供必要的参考。方法1.γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆、表达及筛选:采用基因工程技术,对目的基因进行重组表达,通过SDS-PAGE及酶活的测定检测γ-谷氨酰转肽酶在不同启动子下的表达情况。2.重组谷氨酸棒状杆菌产酶的发酵优化:通过测定不同时间段的酶活及菌体密度,单因素及正交实验确定重组菌的最佳发酵条件。3.GGT酶的提取及性质研究:采用超声及高压均质机破壁,并使用镍柱对GGT进行分离纯化,通过γ-谷氨酰转肽酶活性的测定方法检测其酶学性质。4.CgGT酶学特性的内在机制:通过生物信息学手段及定点突变技术进行分析。5.CgGT在谷氨酸发酵中的应用:采用SBA-40E测定不同时间段的菌体发酵谷氨酸的含量。结果1.γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆、表达及筛选:以C.glutamicum ATCC 13032的基因组为模板,通过PCR技术,成功将其γ-谷氨酰转肽酶的基因（ggt）克隆至Ptac、PmaIEI及PH36三种不同启动子下,形成重组质粒pEKEx2-TC、pEKEx2-MC及pEKEx2-HC,将这三种穿梭质粒转化宿主谷氨酸棒状杆菌原始菌株进行诱导表达,成功筛选出GGT活性是对照组31倍的重组谷氨酸棒状杆菌PTC。2.重组谷氨酸棒状杆菌产酶的发酵优化:通过对筛选出的重组菌PTC的培养工艺进一步的优化,确定了其最佳培养条件为:30℃培养至菌体OD达1.2左右时,向发酵体系中添加终浓度为0.6 mmo l/L的IPTG,诱导培养至27 h;最优培养基为:在本课题组已有的培养基配方基础上,加入Tween-80 0.05%、正十六烷5.0%、山梨醇0.01%,且其最终发酵菌液GGT活力能达到869 U/L,比优化前其活性提高了将近22%。3.GGT酶的提取及性质研究:研究发现该γ-谷氨酰转肽酶属于重组菌PTC的周质酶。使用亲和层析对C端融有His标签的重组CgGT酶进行分离纯化,其分离效果明显,最终纯化后的蛋白酶表现的水解酶比活为5.84 U/mg,为其转肽酶活力的16.67倍。通过SDS-凝胶电泳分析,可知CgGT酶原的分子量为70 kDa,其成熟酶所含大小亚基分子量分别为48及22 kDa。CgGT水解酶的最适pH为7.0,最适反应温度为50℃,该酶在较宽的pH范围内稳定性较好,且重组酶CgGT具有相对较强的的耐热性,在45℃下处理24 h后其活力基本无损失。金属离子Mg2+、Ca2+、Mm2+、K+及Na+在浓度超过5 mol/L的情况下,对酶的活力均有明显的促进作用,尤其是在加入Mg2+和Mn2+的浓度分别为100 mmol/L和50 mmol/L时,CgGT的水解活性分别高达230和202%。4.CgGT酶学特性的内在机制:通过对GGT酶的进化关系、序列比对、同源模型及定点突变的结果进行分析,可知,CgGT酶表现出的酶学性质特点主要是由其独特的底物结合区结构决定的。5.CgGT在谷氨酸发酵中的应用:对强水解酶活性的CgGT提高自身C.glutamicum发酵谷氨酸产量的可行性进行初步的探讨,发现具有高GGT活性的重组菌PTC其在发酵过程中谷氨酸产生量明显高出阴性对照组PP,且在发酵至40 h时,其谷氨酸的产量相比对照组提高了 20%以上。此外,向发酵体系中加入一些酶底物γ-谷氨酰化合物（如Gln、GSH）后,重组菌PTC产酸量能得到进一步的提升,为对照组PP的5.29倍。结论本研究筛选出能高效表达C.glutamicum ATCC 13032 GGT的重组谷氨酸棒状杆菌PTC,其GGT是一个耐温的水解酶,能显着提高C.glutamicum谷氨酸发酵产量。此外,该酶的耐热性及pH不敏感性,对其工业化应用具有较明显的优势,因此该研究对于今后工业化生产谷氨酸具有巨大的商业指导价值。
张宏娟[2]（2013）在《生物催化合成α-氨基酸和手性胺医药中间体研究》文中认为生物催化是高效的温和催化体系,具有优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性。尤其近年来,基因组学、蛋白质组学等生物技术的飞速发展,大大推动了生物催化的基础和应用研究。目前,利用生物体系（如各种细胞和酶）作为催化剂催化合成手性化合物己成为有机合成化学的研究热点以及生物有机化学和生物技术研究的新生长点。本论文采用生物催化方法制备一些重要生理活性的手性化合物,以谷氨酰转移酶、天冬氨酸转氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶为研究对象,结合酶的特性,在天然底物研究的基础上,选择一些非正常底物进行酶催化研究,并通过这些研究揭示酶-底物的催化机制。本论文为高效高选择性合成这些手性化合物提供了新方法,并为它们的进一步研究奠定了基础。为了能够使γ-谷氨酰转移酶催化合成重要的γ-谷氨酰化合物,对酶催化机制进行了研究。制备了十个γ-谷氨酰苯胺类似物,以它们为γ-谷氨酰基供体,乙胺为Y-谷氨酰基受体,经酶催化合成茶氨酸,通过HPLC测定茶氨酸生成量来评价酶活性。以L-γ-谷氨酰对硝基苯胺为底物,对酶转化条件如pH、温度、底物摩尔比等进行优化。在最优转化条件下,分别酶催化十个γ-谷氨酰苯胺类似物形成茶氨酸,测定这些酶转化反应动力学常数,并转换成Hammett方程,结合Hammett曲线表明,γ-谷氨酰转移酶限速酰化反应步骤的反应速度能被吸电子或供电子取代基取代的Y-谷氨酰苯胺类似物加速,此步酰化反应受到动力学酸催化,通过autodock计算模拟,Asp-433羧基或者Tyr-444酚羟基可能是此酸质子来源,此酸质子的进一步确定还需通过实施定点突变。采用γ-谷氨酰转移酶催化合成β-N-（γ-L（+）-谷氨酰）苯肼以及β-N-（γ-L（+）-谷氨酰）对羧基苯肼。合成谷氨酰苯肼最佳反应条件为：配制pH9的转化液,底物浓度为60mM L-谷氨酰胺,300mM苯肼,加入40Uγ,-谷氨酰转移酶/ml,37℃反应6h,底物转化率高达93%；蘑菇氨酸的合成前体,谷氨酰对羧基苯肼最佳反应条件为：50mM L-谷氨酰胺,500mM对羧基苯肼,40U γ-谷氨酰转移酶/ml,pH8、37℃反应24h,产物转化率达90%。虽然苯肼曾被报道为泪腺过氧化酶的自杀性抑制剂,但是苯肼只有在高于300mM浓度时才会可逆性抑制谷氨酰转移酶,而对羧基苯肼即使在1000mM也不会出现抑制现象。这种新的谷氨酰转移酶催化合成方法将有助于合成蘑菇氨酸等重要的谷氨酰化合物,并进一步促进它们的深入研究。光学纯手性胺是一类有重要价值的医药及精细化工中间体,对手性胺类化合物的不对称合成进行更深层次研究具有较大的经济效益和应用价值。目前手性胺的主要制备方法有化学合成、化学及酶法拆分以及酶催化合成,其中酶催化合成更具有优势。本论文以天冬氨酸转氨酶、联用亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶催化合成手性胺及氨基酸。为了更好地了解这些酶的特性,化学合成了8个α-酮酸,天冬氨酸转氨酶对苯丙酮酸钠和邻甲氧基苯丙酮酸钠的转化率较高,邻羟基苯丙酮酸钠和对二甲氨基苯丙酮酸钠的活性则较差；而对于烷基取代α-酮酸,5-甲基-2-酮基已酸钠和4-甲基-2-酮基戊酸钠的转化活性比另外两个烷基取代酮酸好,其最高转化率约为苯丙酮酸钠的60%。另外,本论文还采用天冬氨酸转氨酶催化间羟基苯乙酮合成卡巴拉汀的手性胺中间体3-（1-氨基乙基）苯酚,但天冬氨酸转氨酶催化合成此化合物的能力有限,在加入10%DMSO情况下,其最高转化率不超过40%。联用亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶可制备手性胺化合物。本论文构建了亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶大肠杆菌基因工程菌,将这两种酶联合运用,以上述α-酮酸为底物,考察了反应条件pH、温度、辅酶NAD用量对酶活性影响,在pH9、30℃、1mM NAD的优化条件下,烷基取代α-酮酸反应良好,24h的转化率均在90%左右。除苯丙酮酸钠外,亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶对苯环取代α-酮酸的催化活性都很低。本论文立足于酶催化合成手性化合物,结合基因工程手段重组表达生物酶,为手性化合物的合成拓宽了思路,具有重要的理论意义和应用潜力。
帅玉英[3]（2011）在《γ-谷氨酰转肽酶的纯化和性质及其用于L-茶氨酸的生物制备研究》文中进行了进一步梳理L-茶氨酸是存在于茶叶内的一种主要氨基酸,是一种具有多种生理功能且不会产生任何副作用的一种功能因子,在食品、保健和医疗领域中具有重要的应用价值。因此,研究生物法合成L-茶氨酸具有重要的现实意义。目前生物法生产L-茶氨酸最有效的酶是γ-谷氨酰转肽酶（γ-Glutamyltranspeptidase, GGT, EC 2.3.2.2）。GGT是生物体内谷胱甘肽代谢途径中的关键酶,也是催化转移L-γ-谷氨酰基的特异性酶,可催化L-谷氨酰胺和乙胺合成L-茶氨酸（γ-谷氨酰基-乙胺）,在催化合成方面正成为研究者关注的热点。本研究首先从发酵食品虾酱中通过发酵法产GGT实验和酶法合成L-茶氨酸实验两步筛选法分离得到一株可用来高效合成L-茶氨酸的菌株SK11.004。通过形态观察和生理生化特性实验,结合16S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌,并将其命名为Bacillus subtilis SK11.004。其16S rDNA基因全长为1142 bp,已提交至GenBank数据库,数据库登记号为:FJ437210。GGT的合成与菌体生长同步,发酵16 h产酶活力最高,达到2.5 U/mL。在筛选获得Bacillus subtilis SK11.004的基础上,建立了以L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐为底物通过发酵液酶促反应合成L-茶氨酸的工艺,并完成了中试生产。首先对酶促反应条件进行了优化,在最适反应条件下,副反应得到了有效的抑制,L-茶氨酸的转化率约为94%,纯度达65.2%。此外,还建立了L-茶氨酸的脱色及分离纯化工艺,通过串联使用阴阳离子交换树脂去除反应液中的L-谷氨酸及其它杂质,再经洗脱、减压浓缩干燥,获得L-茶氨酸,纯度达到85%,收率为80.4%。最后建立了L-茶氨酸的结晶工艺,在优化后的结晶工艺条件下,晶体得率为48%,晶体纯度达97%,并利用扫描电镜对其晶体形态进行了扫描,晶体呈规则的致密的方形层状结构。对B. subtilis SK11.004的发酵液进行了分离纯化,采用超滤、硫酸铵沉淀、疏水作用层析和凝胶过滤等手段,得到两种具有GGT活力的酶（GGT-1与GGT-2）,比酶活分别达到684.9和193 U/mg。通过Native-PAGE、SDS-PAGE和凝胶过滤色谱对酶的纯度和分子量进行测定,结果表明GGT-1为二聚体,包含两个亚基（40 kDa和21 kDa）,分子量约为62 kDa;GGT-2为单体酶,分子量约为58 kDa。对比酶活高的GGT-1的酶学性质进行了系统研究。其转肽反应的最适pH为10;水解反应的最适pH为8.0;在pH6-12的缓冲液中酶活稳定性良好;等电点为7.8,说明该酶处于兼性离子及负离子时,才能更好地发挥活力;该酶的最适反应温度为37 oC,在50 oC以下具有良好的稳定性;Na+和Ca2+对酶活影响不明显,Al3+和Mg2+能促进酶活力,Cu2+和Zn2+对GGT的酶活有明显抑制作用,Zn2+的抑制作用最强,可抑制32.2%的活力,而酸根离子SO42-、Cl-、NO3-对酶活基本没有影响。另外,EDTA对酶活基本没有影响,说明GGT-1并非金属蛋白酶。对GGT-1的底物特异性进行研究,结果说明,空间位阻的大小、氨基酸的酸碱性是影响活力的最主要因素,侧链的增加以及酸性的增强会导致酶与底物亲和力的下降,且空间位阻的影响要大于酸碱性的影响。此外,底物的立体异构性对于酶的转肽活力也有一定影响。GGT-1对于谷氨酰供体具有相对低的Km值,而对于谷氨酰受体则具有高的Km值。对于γ-GpNA具有低的亲和力,而对于L-Gln亲和力高一些。L-Gln转肽反应和水解反应的特征常数Km分别为0.83和3.16 mM,说明GGT-1易于催化L-Gln进行转肽反应。该酶催化反应速率较快,催化效率较高,可用于γ-谷氨酰类化合物的的生物转化。化学修饰剂PMSF和NBS对酶蛋白的活性影响显着,表明羟基和色氨酸残基均是GGT-1酶活性功能的必需基团。添加底物对NBS对酶的修饰不起保护作用,说明被修饰的色氨酸残基可能不处在酶与底物的契合部位,但它是维持酶空间结构保持其活性必需的基团,而底物的添加对PMSF对酶的修饰有一定保护作用,表明羟基处于底物结合区域。圆二色谱进一步考察了经PMSF和NBS修饰后GGT-1二级结构的变化。结果表明,GGT-1的二级结构由34.4%α-螺旋、11.7%β-折叠、22.2%转角和31.7%无规卷曲组成。经5 mmol/L PMSF处理1h后,其α-螺旋含量由34.4%减少至23.1%,β-折叠和无规卷曲的含量分别增加至17.6%和42.2%,而β-转角的含量则下降至17.1%,说明酶蛋白的二级结构受到了一定程度的破坏。而GGT被1mmol/L NBS修饰后,仅剩余6.8%的α-螺旋,其余结构均转变成了无规卷曲,基本失去了蛋白结构特征,进一步证实了色氨酸残基对于维持酶空间结构的重要性。对GGT-1进行了质谱鉴定,经数据库检索,获得一个Mascot score达到84的有效匹配,匹配蛋白为来自Bacillus amyloliquefaciens FZB42的GGT,氨基酸覆盖率达18%,初步判断GGT-1为γ-谷氨酰转肽酶。经492cLC型蛋白质测序仪分析,GGT-1大亚基的N端结构前八个氨基酸残基连接依次为:FSYDTYKQ。与通过肽指纹图谱匹配到的蛋白质比对,基本与其第35个氨基酸至第43个氨基酸吻合。证实肽指纹图谱鉴定的准确性。结合肽指纹图谱和N端测序结果,确证GGT-1是一种新的γ-谷氨酰转肽酶,且与B. amyloliquefaciens FZB42 GGT具有较近的同源性。
贺忠,荀志金[4]（2004）在《用Bacillus subtilis NX-2菌株谷氨酰转肽酶催化合成S-苄基-谷胱甘肽》文中进行了进一步梳理S 苄基 谷胱甘肽是合成谷胱甘肽的一种重要前体化合物。以L 谷氨酰胺为供体 ,S 苄基 半胱氨酰甘氨酸为受体 ,用BacillussubtilisNX 2的γ 谷氨酰转肽酶催化进行转肽反应 ,合成得到S 苄基 谷胱甘肽。该化合物进行了质谱及核磁共振分析 ,并得到了初步鉴定
贺忠[5]（2004）在《γ-谷氨酰转肽酶在谷胱甘肽前体合成中的应用研究》文中提出还原型谷胱甘肽（GSH）是维持机体内环境稳定所不可缺少的物质,是机体代谢中某些酶的辅酶,其还原性巯基参与体内重要的氧化还原反应,而使机体产生免疫能力。GSH具有广的医药用途,尤其对中毒性疾病和肝脏疾病的治疗,有明显疗效,因此引起国内外医药研究人员的重视,但谷胱甘肽的制备方法,一直是研究的难点,至今仍是国内外研究的热点。 按GSH生产方法的发展进程来看,主要有提取法、化学合成法、微生物发酵法、化学-酶法。1989年,Hidehiko Kumagai等人利用基因工程菌E.coli K-12菌株发酵所产的γ-谷氨酰转肽酶合成了S-苄基-谷胱甘肽,该物质脱去苄基保护基,即获得谷胱甘肽,该方法有望开辟一条制备谷胱甘肽的新路线。 本文利用Bacillus subtilis NX-2菌株的γ-谷氨酰转肽酶为催化剂,以L-谷氨酰胺作为γ-谷氨酰基供体,S-苄基-半胱氨酰甘氨酸作为γ-谷氨酰基受体,进行酶促转肽反应合成S-苄基-谷胱甘肽。该法可以省去化学合成法中复杂的保护和脱保护处理工序,简化反应流程,提高反应收率。 本文首先对S-苄基-半胱氨酰甘氨酸的合成工艺条件进行了优化,以S-苄基-半胱氨酸为原料,经过氨基保护,与甘氨酸甲酯的接肽以及氨基的脱保护,即可得到S-苄基-半胱氨酰甘氨酸。研究结果表明:三步合成反应的反应转化率分别可以达到84.2%,88.9%和91%。 然后,对本实验室所保藏的Bacillus subtilis NX-2菌株进行发酵产酶研究,对获得的γ-谷氨酰转肽酶进行初步纯化,此后,对γ-谷氨酰转肽酶粗酶性质做了初步研究,考察了该粗酶的pH稳定性和最适pH、温度稳定性和最适温度以及金属离子对γ—谷氨酰转肽酶活性的影响。研究结果表明:该酶在pH7.0～10.0稳定性最好,最适催化反应pH值为8.0;在低于40℃的温度下,该酶有着较好的稳定性,最适催化反应温度为40℃;K+、Na+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+的存在对该酶的活性不产生明显的抑制作用,而Fe2+、Fe3+、Hg2+则对该酶表现出明显的抑制作用。 最后,本文对酶促转肽合成S-苄基-谷胱甘肽进行了工艺研究,该研究在国内还未曾报道。在γ—谷氨酰转肽酶的最适温度和最适pH下,本文考察了反应
二、用Bacillus subtilis NX-2菌株谷氨酰转肽酶催化合成S-苄基-谷胱甘肽（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用Bacillus subtilis NX-2菌株谷氨酰转肽酶催化合成S-苄基-谷胱甘肽（论文提纲范文）
（1）C.glutamicum γ-谷氨酰转肽酶的重组表达、酶学性质及其在谷氨酸发酵中应用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 γ-谷氨酰胺转肽酶的概述 |
| 1.1.1 γ-谷氨酰转肽酶的来源及分布 |
| 1.1.2 γ-谷氨酰转肽酶的分子结构及分子量 |
| 1.1.3 y-谷氨酰转肽酶的催化特性 |
| 1.1.4 γ-谷氨酰转肽酶的应用 |
| 1.2 谷氨酸棒状杆菌的概述 |
| 1.2.1 谷氨酸棒状杆菌简介 |
| 1.2.2 谷氨酸棒状杆菌的基因调控 |
| 1.2.3 谷氨酸棒状杆菌的主要产物 |
| 1.3 本课题的研究意义及内容 |
| 1.3.1 本课题立题依据和意义 |
| 1.3.2 本课题主要研究内容 |
| 第2章 C.glutamicum ATCC 13032 γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆、表达及筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌种和质粒 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 含有不同启动子的表达载体的构建 |
| 2.3.2 含有不同启动子的ggt基因在C.glutamicum ATCC 13032中的表达 |
| 2.3.3 重组γ-谷氨酰转肽表达分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 γ-谷氨酰转肽酶的核苷酸序列及其推演的氨基酸序列 |
| 2.4.2 含有不同启动子的表达载体的构建 |
| 2.4.3 含有不同启动子的ggt基因在重组C.glutamicum中的表达 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 重组谷氨酸棒状杆菌产GGT酶的发酵优化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组菌生长与γ-谷氨酰转肽酶产生的偶联曲线 |
| 3.3.2 不同促进剂对γ-谷氨酰转肽酶产生的影响研究 |
| 3.3.3 重组γ-谷氨酰转肽表达分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 重组菌生长与产酶的偶联关系 |
| 3.4.2 不同促进剂对重组菌发酵产酶的影响研究 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 γ谷氨酰转肽酶的分离纯化和性质研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌种 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 培养基 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 γ-谷氨酰转肽在发酵体系中的分布 |
| 4.3.2 γ-谷氨酰转肽酶的分离纯化 |
| 4.3.3 γ-谷氨酰转肽酶性质的研究 |
| 4.3.4 γ-谷氨酰转肽酶的分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 γ-谷氨酰转肽在发酵体系中的分布 |
| 4.4.2 重组γ-谷氨酰转肽酶的分离纯化 |
| 4.4.3 γ-谷氨酰转肽酶性质的研究 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 CgGT酶学特性的结构基础及其在谷氨酸发酵中的应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌种和质粒 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 培养基 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 y-谷氨酰转肽酶结构分析 |
| 5.3.2 突变体的构建 |
| 5.3.3 γ-谷氨酰转肽酶的活性测定 |
| 5.3.4 突变体γ-谷氨酰转肽酶的分离纯化 |
| 5.3.5 酶动力学测定 |
| 5.3.6 C.glutamicum γ-谷氨酰转肽酶在谷氨酸发酵中的应用 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 γ-谷氨酰转肽酶的酶学特性结构基础 |
| 5.4.2 CgGT在C.glutamicum原始菌株对发酵谷氨酸的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 总体讨论与展望 |
| 6.1 总体讨论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（2）生物催化合成α-氨基酸和手性胺医药中间体研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 谷氨酰转移酶催化合成蘑菇氨酸类似物研究 |
| 第一节 文献综述 |
| 1.1 谷氨酰转移酶概况 |
| 1.2 谷氨酰转移酶催化作用 |
| 1.3 Hammett方程 |
| 1.4 γ-谷氨酰转移酶在生物催化中的应用 |
| 1.5 重要的谷氨酰化合物——蘑菇氨酸 |
| 第二节 谷氨酰转移酶催化机理研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料和试剂 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 γ-谷氨酰苯胺类似物化学合成 |
| 2.1.4 重组谷氨酰转移酶工程菌的培养及诱导表达 |
| 2.1.5 谷氨酰转移酶分离纯化 |
| 2.1.6 谷氨酰转移酶活性测定 |
| 2.1.7 谷氨酰转移酶催化反应动力学研究 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 有关L-谷氨酰苯胺类似物合成 |
| 2.2.2 茶氨酸浓度分析 |
| 2.2.3 pH和温度对谷氨酰转移酶活性影响 |
| 2.2.4 底物摩尔比对谷氨酰转移酶活性影响 |
| 2.2.5 谷氨酰转移酶底物特异性及反应动力学研究 |
| 2.3 结论 |
| 第三节 谷氨酰转移酶催化合成谷氨酰苯肼研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试剂与仪器 |
| 3.1.2 重组大肠杆菌谷氨酰转移酶构建与纯化 |
| 3.1.3 谷氨酰转移酶的活性分析和产物浓度测定 |
| 3.1.4 制备β-N-(γ-L(+)-谷氨酰基)苯肼 |
| 3.1.5 测定苯肼抑制谷氨酰转移酶性质 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 pH与温度对谷氨酰转移酶活性影响 |
| 3.2.2 底物摩尔比对谷氨酰转移酶活性影响 |
| 3.2.3 底物苯肼浓度对谷氨酰转移酶活性影响 |
| 3.2.4 苯肼可逆性抑制谷氨酰转移酶 |
| 3.2.5 讨论 |
| 第四节 谷氨酰转移酶催化合成谷氨酰对羧基苯肼研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试剂与仪器 |
| 4.1.2 重组大肠杆菌谷氨酰转移酶的构建与纯化 |
| 4.1.3 谷氨酰转移酶的活性分析和产物浓度测定 |
| 4.1.4 谷氨酰转移酶催化合成β-N-(γ-L(+)-谷氨酰基)-4-羧基苯肼 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 pH和温度对谷氨酰转移酶活性影响 |
| 4.2.2 底物摩尔比和底物浓度对谷氨酰转移酶活性影响 |
| 4.2.3 酶法合成β-N-(γ-L(+)-谷氨酰基)对羧基苯肼 |
| 4.3 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 天冬氨酸转氨酶催化合成手性胺及α-氨基酸研究 |
| 第一节 文献综述 |
| 1.1 酶催化动力学拆分手性胺 |
| 1.1.1 脂肪酶水解拆分手性胺 |
| 1.1.2 转氨酶拆分手性胺 |
| 1.2 酶催化的动态动力学拆分手性胺 |
| 1.3 转氨酶不对称合成手性胺 |
| 1.4 (S)-卡巴拉汀合成方法 |
| 1.4.1 (S)-卡巴拉汀化学合成方法 |
| 1.4.2 化学-酶法合成卡巴拉汀路径 |
| 1.5 亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶联用催化转氨反应 |
| 第二节 芳基和烷基取代的α-酮酸化学合成 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料和试剂 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 化学法合成芳基取代α-酮酸 |
| 2.1.4 化学法合成烷基取代α-酮酸 |
| 2.2 实验讨论 |
| 2.2.1 有关化学法合成芳基取代α-酮酸实验讨论 |
| 2.2.2 有关化学法合成烷基取代α-酮酸实验讨论 |
| 2.3 结论 |
| 第三节 天冬氨酸转氨酶催化合成α-氨基酸 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料和试剂 |
| 3.1.2 主要实验仪器 |
| 3.1.3 重组天冬氨酸转氨酶工程菌的培养及诱导表达 |
| 3.1.4 酶法转化及酶活测定 |
| 3.1.5 天冬氨酸转氨酶催化合成α-氨基酸路线 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 芳基取代的α-酮酸转化结果与讨论 |
| 3.2.2 烷基取代的α-酮酸转化结果与讨论 |
| 3.3 结论 |
| 第四节 天冬氨酸转氨酶催化合成手性3-(1-氨基乙基)苯酚 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料和试剂 |
| 4.1.2 主要实验仪器 |
| 4.1.3 重组天冬氨酸转氨酶工程菌的培养及诱导表达 |
| 4.1.4 酶法转化及酶活测定 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 pH、温度、有机溶剂DMSO对酶活性影响 |
| 4.2.2 DMSO的加入量对酶活性影响 |
| 4.2.3 其他有机溶剂对天冬氨酸转氨酶催化活性影响 |
| 4.2.4 底物间羟基苯乙酮浓度对酶活性影响 |
| 4.3 结论 |
| 第三章 联用亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶催化合成α-氨基酸研究 |
| 第一节 亮氨酸脱氢酶基因工程菌构建 |
| 1.1 主要实验材料 |
| 1.1.1 主要实验试剂 |
| 1.1.2 主要实验仪器 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 亮氨酸脱氢酶基因工程菌(pETDuet-leudh/E.coli BL21(DE3))构建 |
| 1.2.2 亮氨酸脱氢酶基因工程菌诱导表达 |
| 1.2.3 亮氨酸脱氢酶基因工程菌酶活性测定 |
| 1.3 实验结果与讨论 |
| 1.3.1 重组质粒pETDuet-leudh构建 |
| 1.3.2 亮氨酸脱氢酶活性测定 |
| 1.4 结论 |
| 第二节 甲酸脱氢酶基因工程菌构建 |
| 2.1 主要实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 甲酸脱氢酶基因工程菌(pETDuet-fdh/E.coli BL21(DE3))构建 |
| 2.2.2 甲酸脱氢酶基因工程菌诱导表达 |
| 2.2.3 甲酸脱氢酶基因工程菌酶活性测定 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 重组质粒pETDuet-fdh构建 |
| 2.3.2 甲酸脱氢酶活性测定 |
| 2.4 结论 |
| 第三节 亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶联用催化合成α-氨基酸 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料和试剂 |
| 3.1.2 主要实验仪器 |
| 3.1.3 重组甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶工程菌的培养及诱导表达 |
| 3.1.4 酶法转化及酶活测定 |
| 3.2 双酶系统催化烷基取代α-酮酸结果与讨论 |
| 3.2.1 pH、温度对酶活性影响 |
| 3.2.2 NAD的加入量对酶活性影响 |
| 3.3 双酶系统催化芳基取代α-酮酸结果与讨论 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 附图：部分氢谱图 |
| 攻读博士学位期间论文发表及相关情况 |
| 致谢 |
（3）γ-谷氨酰转肽酶的纯化和性质及其用于L-茶氨酸的生物制备研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 L-茶氨酸 |
| 1.1.1 L-茶氨酸的分布 |
| 1.1.2 L-茶氨酸的理化性质 |
| 1.1.3 L-茶氨酸在茶树体内的代谢 |
| 1.1.4 L-茶氨酸在人体内的代谢 |
| 1.2 L-茶氨酸的生理功能和应用前景 |
| 1.2.1 L-茶氨酸的生理功能 |
| 1.2.2 L-茶氨酸的应用前景 |
| 1.3 工业化生产L-茶氨酸的可能途径 |
| 1.3.1 提取分离法 |
| 1.3.2 化学合成法 |
| 1.3.3 植物组织或细胞培养法生产L-茶氨酸 |
| 1.3.4 微生物酶法生产L-茶氨酸 |
| 1.4 γ-谷氨酰转肽酶的研究进展 |
| 1.4.1 γ-谷氨酰转肽酶的微生物来源 |
| 1.4.2 GGT 的性质 |
| 1.4.3 在催化合成上的应用 |
| 1.5 本课题的立题依据和意义 |
| 1.6 本课题研究思路与主要内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 γ-谷氨酰转肽酶产生菌种的分离、筛选及鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要材料 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 菌种来源 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.2.5 菌种筛选 |
| 2.2.6 菌种鉴定 |
| 2.2.7 GGT 酶活力的测定 |
| 2.2.8 L-茶氨酸含量的测定 |
| 2.2.9 菌体生长浊度的测定 |
| 2.2.10 遗传稳定实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 菌种的筛选 |
| 2.3.2 菌种鉴定 |
| 2.3.3 遗传稳定研究试验 |
| 2.3.4 B. subtilis SK11.004 发酵生产GGT 的过程曲线 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 酶法生产L-茶氨酸的工艺研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 GGT 转肽活力测定方法 |
| 3.2.4 L-茶氨酸含量的测定方法 |
| 3.2.5 粗酶液的制备 |
| 3.2.6 酶反应条件的优化 |
| 3.2.7 L-茶氨酸原料液的脱色处理 |
| 3.2.8 离子交换树脂分离纯化L-茶氨酸 |
| 3.2.9 L-茶氨酸的结晶 |
| 3.2.10 L-茶氨酸的鉴定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 酶法合成最佳反应条件 |
| 3.3.2 L-茶氨酸料液的脱色处理 |
| 3.3.3 L-茶氨酸的分离纯化 |
| 3.3.4 L-茶氨酸的结晶 |
| 3.3.5 L-茶氨酸的鉴定 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 γ-谷氨酰转肽酶的分离纯化 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种 |
| 4.2.2 主要实验材料 |
| 4.2.3 主要实验仪器 |
| 4.2.4 粗酶液的制备 |
| 4.2.5 超滤 |
| 4.2.6 硫酸铵分级沉淀 |
| 4.2.7 HiprepTM phenyl FF(high sub) 16/10 疏水层析 |
| 4.2.8 Superdex 75 HiLoad 10/300 prep grade 凝胶过滤层析 |
| 4.2.9 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)鉴定 |
| 4.2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 |
| 4.2.11 酶液中蛋白质含量的测定 |
| 4.2.12 GGT 活力测定方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 硫酸铵分级沉淀 |
| 4.3.2 HiprepTM phenyl FF(high sub) 16/10 疏水层析 |
| 4.3.3 Superdex 75 HiLoad 10/300 prep grade 凝胶过滤层析 |
| 4.3.4 Superdex 75 凝胶色谱确定GGT 分子量 |
| 4.3.5 纯化结果及SDS-PAGE 电泳鉴定 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 γ-谷氨酰转肽酶的性质研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 主要实验仪器 |
| 5.2.3 GGT-1 转肽活力测定方法 |
| 5.2.4 GGT-1 水解活力测定方法 |
| 5.2.5 蛋白质含量的测定方法 |
| 5.2.6 L-谷氨酰胺，L-谷氨酸与L-茶氨酸的检测方法 |
| 5.2.7 温度对酶活及热稳定性的影响 |
| 5.2.8 pH 对酶活的影响 |
| 5.2.9 金属离子对酶活的影响 |
| 5.2.10 底物专一性 |
| 5.2.11 反应动力学常数的测定 |
| 5.2.12 等电点的测定 |
| 5.2.13 化学修饰剂对酶活的影响 |
| 5.2.14 GGT-1 的圆二色谱 |
| 5.2.15 GGT-1 的质谱鉴定 |
| 5.2.16 N 端结构测定 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 pH 对酶活及稳定性的影响 |
| 5.3.2 温度对酶活及热稳定性的影响 |
| 5.3.3 金属离子对酶活的影响 |
| 5.3.4 GGT-1 的底物特异性研究 |
| 5.3.5 GGT-1 的反应动力学常数 |
| 5.3.6 GGT-1 的等电点的测定 |
| 5.3.7 GGT-1 活性功能的必需基团的研究 |
| 5.3.8 化学修饰剂对GGT-1 二级结构的影响 |
| 5.3.9 GGT-1 的质谱鉴定 |
| 5.3.10 GGT-1 的N 端结构测定 |
| 5.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 论文主要结论 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 附录1：N-端结构分析图谱及标准氨基酸分析图谱 |
| 附录2：GGT-1 电喷雾质谱ESI-MS 分析质量肽谱 |
| 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（4）用Bacillus subtilis NX-2菌株谷氨酰转肽酶催化合成S-苄基-谷胱甘肽（论文提纲范文）
| 1 实验材料与实验方法 |
| 1.1 仪器与试剂 |
| 1.1.1 菌种 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 γ-谷氨酰转肽酶的初步纯化 |
| 1.2.2 γ-谷氨酰肽酶的检测 |
| 1.2.2.1 酶活定义[7] |
| 1.2.2.2 比酶活 |
| 1.2.3 酶催化合成S-苄基-谷胱甘肽 |
| 1.2.4 产物的分离纯化 |
| 1.2.5 产物定量分析方法 |
| 1.2.6 产物的鉴定 |
| 1.2.6.1 质谱分析方法 |
| 1.2.6.2 核磁共振氢谱分析方法 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 γ-谷氨酰转肽酶的初步纯化 |
| 2.2 反应物摩尔比对反应的影响 |
| 2.3 产物的分离纯化 |
| 2.4 线性方程和线性范围 |
| 2.5 产物的鉴定 |
| 2.5.1 质谱分析结果 (图3) |
| 2.5.2 核磁共振分析结果特征峰分析 |
| 3 结论 |
（5）γ-谷氨酰转肽酶在谷胱甘肽前体合成中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 谷胱甘肽的研究背景 |
| 1.1.1 谷胱甘肽的理化性质 |
| 1.1.2 谷胱甘肽的生物学功能 |
| 1.1.2.1 参与氨基酸的吸收和转运 |
| 1.1.2.2 维持红细胞的完整性，清除体内自由基 |
| 1.1.2.3 参与血红蛋白的还原作用 |
| 1.1.3 谷胱甘肽的应用 |
| 1.1.3.1 在食品中的应用 |
| 1.1.3.2 在医学上的应用 |
| 1.1.4 谷胱甘肽的生产方法 |
| 1.2 γ-谷氨酰转肽酶的研究背景 |
| 1.2.1 γ-谷氨酰转肽酶的酶源 |
| 1.2.2 γ-谷氨酰转肽酶的酶学性质 |
| 1.2.3 γ-谷氨酰转肽酶的功能 |
| 1.2.4 γ-谷氨酰转肽酶的应用 |
| 1.2.4.1 临床医学上的应用 |
| 1.2.4.2 在生物合成中的应用 |
| 1.3 本论文研究目的及研究内容 |
| 1.3.1 研究目的 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 第二章 S-苄基-半胱氨酰甘氨酸的合成 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 S-苄基-半胱氨酸的氨基保护 |
| 2.2.1 实验方法 |
| 2.2.1.1 氯甲酸苄酯的标定 |
| 2.2.1.2 S-苄基-N-苄氧羰基-半胱氨酸的合成 |
| 2.2.2 结果与讨论 |
| 2.2.2.1 反应温度对反应转化率的影响 |
| 2.2.2.2 反应物摩尔比对反应转化率的影响 |
| 2.3 S-苄基-N-苄氧羰基-半胱氨酰甘氨酸甲酯的合成 |
| 2.3.1 实验原理 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 结果与讨论 |
| 2.3.3.1 初始温度对产物收率的影响 |
| 2.3.3.2 三乙胺的用量对产物收率的影响 |
| 2.3.3.3 DCC用量对产物收率的影响 |
| 2.4 氨基去保护合成S-苄基-半胱氨酰甘氨酸甲酯 |
| 2.4.1 实验方法 |
| 2.4.1.1 溴化氢的醋酸溶液的制备 |
| 2.4.1.2 利用溴化氢的醋酸溶液脱除苄氧羰基 |
| 2.4.1.3 催化氢解法脱除苄氧羰基 |
| 2.4.2 结果与讨论 |
| 2.4.2.1 溴化氢的醋酸溶液脱除苄氧羰基 |
| 2.4.2.2 催化氢解法脱除苄氧羰基 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 γ-谷氨酰转肽酶的性质的初步研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.1 菌种 |
| 3.1.1.2 培养基 |
| 3.1.1.3 主要试剂 |
| 3.1.1.4 实验仪器 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 γ-谷氨酰转肽酶初步纯化 |
| 3.1.2.2 γ-谷氨酰肽酶检测方法 |
| 3.1.2.3 考察pH环境对酶活力的影响 |
| 3.1.2.4 考察温度对酶活力的影响 |
| 3.1.2.5 金属离子对γ-谷氨酰转肽酶活性的影响 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 酶转化反应的分光光度检测曲线 |
| 3.2.2 γ-谷氨酰转肽酶富集效果 |
| 3.2.3 pH环境对酶活力的影响 |
| 3.2.4 温度对酶活力的影响 |
| 3.2.5 金属离子对酶活性的影响 |
| 3.3 结论 |
| 第四章 γ-谷氨酰转肽酶催化合成S-苄基谷胱甘肽 |
| 4.1 实验材料与实验方法 |
| 4.1.1 仪器与试剂 |
| 4.1.1.1 试剂 |
| 4.1.1.2 实验仪器 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.2.1 酶催化合成S-苄基-谷胱甘肽 |
| 4.1.2.2 产物的分离纯化 |
| 4.1.2.3 产物定量分析方法 |
| 4.1.2.4 产物的鉴定 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 反应物摩尔比对反应的影响 |
| 4.2.2 产物的分离纯化 |
| 4.2.3 线性方程和线性范围 |
| 4.2.4 产物的鉴定 |
| 4.3 结论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 成果 |
| 致谢 |
四、用Bacillus subtilis NX-2菌株谷氨酰转肽酶催化合成S-苄基-谷胱甘肽（论文参考文献）
- [1]C.glutamicum γ-谷氨酰转肽酶的重组表达、酶学性质及其在谷氨酸发酵中应用的研究[D]. 熊爱英. 南京师范大学, 2016(02)
- [2]生物催化合成α-氨基酸和手性胺医药中间体研究[D]. 张宏娟. 南京大学, 2013(08)
- [3]γ-谷氨酰转肽酶的纯化和性质及其用于L-茶氨酸的生物制备研究[D]. 帅玉英. 江南大学, 2011(12)
- [4]用Bacillus subtilis NX-2菌株谷氨酰转肽酶催化合成S-苄基-谷胱甘肽[J]. 贺忠,荀志金. 生物加工过程, 2004(04)
- [5]γ-谷氨酰转肽酶在谷胱甘肽前体合成中的应用研究[D]. 贺忠. 南京工业大学, 2004(03)