重组pIRES2-EGFP-hBMP2载体的构建及其对人牙龈成纤维细胞表型的影响

论文摘要

牙周治疗的最终目标是实现牙周组织完全功能性再生,其中包括牙龈、牙周膜、牙骨质和牙槽骨协调一致地、生理性再生。传统的牙周治疗和引导性组织再生技术虽取得一定的临床效果,但总的看来,尚不能达到牙周组织完全再生的目的。组织工程技术引入牙周病治疗的研究领域,为这一目标的实现带来了新的希望。组织工程学研究的主要内容包括种子细胞的来源、生物载体支架的选择以及细胞/载体支架复合体的构建等三个方面。种子细胞的研究是牙周组织工程的重要内容。牙周膜（PDL）细胞是一组具有多向分化潜能的异质性细胞,其中的未分化间充质细胞可分化为成纤维细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞,是牙周组织再生的主要细胞。作为种子细胞,PDL细胞具有一定的局限性,它来源有限,须拔除一定量自体牙后才能获得,难以在临床上广泛开展。牙龈成纤维细胞作为牙周组织的组成成分,来源丰富、容易获得、具有很强的生长和自我繁殖能力,在适当的刺激下,可表达成骨细胞表型。人骨形成蛋白2（hBMP2）是BMP家族中诱骨活性最强的一种,也是唯一能单独诱导成骨的因子,在牙周组织再生和修复中具有重要的作用。本研究利用基因转染技术,将hBMP2基因转染牙龈成纤维细胞,赋予其成骨细胞特性,探讨将其作为理想的种子细胞应用于牙周组织工程的可能性。为此,本研究进行了如下几方面的实验:①用RT-PCR方法从人成骨肉瘤细胞系OS-9901中成功克隆了hBMP2基因,测序鉴定完全正确后,通过基因重组技术成功构建了该基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2,该实验结果为后续研究hBMP2对牙龈成纤维细胞表型的影响奠定了基础。②利用脂质体转染法成功地将hBMP2基因转入人牙龈成纤维细胞中,经G418筛选后,获得了稳定表达hBMP2的细胞克隆;通过荧光显微镜、RT-PCR、蛋白印迹和ELISA等方法进一步检测了稳定转染细胞中hBMP2的表达情况,实验结果表明本实验获得了稳定表达hBMP2的转染细胞,此细胞可稳定表达分泌型hBMP2达至少9代以上。③在上述实验的基础上,对稳定表达hBMP2的人牙龈成纤维细胞从形态、增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶活性和骨钙素合成以及体外形成矿化结节的能力等方面,对其生物学特性进行了观察。结果显示,部分转染细胞由梭形转化为多角形;细胞倍增时间和细胞增殖周期无明显改变;与未转染细胞相比,转染细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素合成水平明显升高（P<0.01）;并在矿化液作用下形成矿化结节。结果提示:hBMP2基因转染后人牙龈成纤维细胞生物学特性发生明显改变,表达成骨细胞表型,具有了某些成骨细胞的特点。本实验结论:外源性的hBMP2基因能够在牙龈成纤维细胞中稳定表达并促进其向成骨细胞转化,因此,可以初步认为hBMP2基因转染牙龈成纤维细胞具能作为牙周组织工程种子细胞的潜在可能。

论文目录

• 缩写词表
• 中文摘要
• Abstract
• 文献回顾
• 第一部分 BMP生物学特性及其在牙周组织再生中的作用
• 第二部分 基因转染技术在牙周组织修复再生中的应用
• 前言
• 正文
• 1 重组真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP-2的构建与鉴定
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 实验结果
• 1.4 实验讨论
• 2 hBMP2基因在人牙龈成纤维细胞内的稳定表达及鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 实验讨论
• 3 hBMP2基因转染人牙龈成纤维细胞后的生物学特性研究
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 实验讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和发表论文
• 致谢