Slit-2在嗅鞘细胞迁移中的作用及其机制研究

论文摘要

嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells,OECs）是一类能促进轴突生长的神经胶质细胞。嗅鞘细胞在移植治疗轴突损伤和去髓鞘化疾病的研究中显示出潜在的临床应用前景。然而,目前对于嗅鞘细胞的基本生物学问题研究甚少。在胚胎发育过程中,嗅鞘细胞起源于嗅上皮,并从嗅上皮迁移进入嗅球,在嗅球的嗅神经层形成胶质细胞屏障。目前对于嗅鞘细胞从嗅上皮迁移进入嗅球的分子机制研究尚不清楚。为了更好地研究嗅鞘细胞方向性迁移问题,我们首先开发了一种研究嗅鞘细胞方向性迁移的平台-单细胞迁移平台。基于该平台,我们实时观察单个分离的嗅鞘细胞,研究其运动特性。实验中,我们发现嗅鞘细胞各个亚群分别具有不同的运动特性,而这些不同的运动特性可能依赖于其特异的细胞骨架结构。另外,在迁移的嗅鞘细胞前方给予lysophosphatidic acid（LPA）浓度梯度,嗅鞘细胞不同亚群显示出不同迁移反应。最后,我们发现嗅鞘细胞亚群能自发地进行相互间转化。这些证据首次证明了不同嗅鞘细胞亚群呈现出不同运动特性,并且能自发地相互间转换,为嗅鞘细胞是一种单一的细胞类型,具有多种功能性的亚群形态的观点提供了新的实验证据。进一步我们研究发现在胚胎发育过程中Slit-2高表达于嗅上皮,其受体Robo-1表达于嗅鞘细胞。运用组织块共培养和群体迁移模型,发现Slit-2排斥嗅鞘细胞迁移。进一步在单细胞迁移平台上,发现Slit-2的浓度梯度引发嗅鞘细胞前导突起塌缩和胞体的翻转迁移。在这个过程中,我们观察到Slit-2浓度梯度引起了IP3受体通道依赖的胞内钙离子浓度的上升,介导了Slit-2引发的嗅鞘细胞塌缩和翻转。钙离子信号通过calcineruin激活F-actin severing蛋白cofilin,剪切外周F-actin引起骨架的重排,引发前导突起的塌缩,另一方面,钙离子信号通过抑制RhoA的活性引发胞体迁移的翻转。最后我们发现,F-actin和RhoA联合抑制剂完全模拟了Slit-2对嗅鞘细胞迁移的作用。因此,Slit-2引起嗅鞘细胞排斥性迁移是通过局部的钙离子-cofilin的激活引发塌缩和整体RhoA活性抑制相互调节协调完成的。这些研究结果为嗅鞘细胞在发育过程迁移的分子机制提供了理论依据,并丰富了Slit/Robo功能及机制的研究。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 英文摘要
• 目次
• 正文部分
• 第一章 基于单细胞迁移方法研究离体培养嗅鞘细胞运动性
• 1.引言
• 1.1 嗅鞘细胞概述
• 1.2 嗅鞘细胞亚型
• 1.3 嗅鞘细胞运动学特性
• 2.实验材料与方法
• 2.1 嗅鞘细胞原代培养及纯化
• 2.2 嗅鞘细胞单细胞迁移平台的搭建
• 2.3 细胞免疫化学
• 2.4 统计学处理
• 3.实验结果
• 3.1 原代培养嗅鞘细胞亚群分类
• 3.2 嗅鞘细胞各亚群呈现出不同的迁移模式和运动能力
• 3.3 在不同的细胞基质上嗅鞘细胞各亚型同样表现不同运动能力
• 3.4 嗅鞘细胞各亚型骨架重排形式
• 3.5 嗅鞘细胞各亚型对外界因子LPA浓度梯度的反应
• 3.6 嗅鞘细胞各亚型自发地相互间转换
• 4.实验讨论
• 第二章 Slit-2在嗅鞘细胞迁移中的作用及其机制的研究
• 1.引言
• 1.1 嗅鞘细胞的迁移机制及研究意义
• 1.2 排斥性因子Slits/Robos系统
• 1.3 Slits/Robos系统与嗅觉系统发育
• 2.实验材料与方法
• 2.1 嗅鞘细胞原代培养及纯化
• 2.2 嗅鞘细胞单细胞迁移平台的搭建
• 2.3 免疫化学
• 2.3.1 细胞免疫化学
• 2.3.2 组织免疫化学
• 2.4 Slit-2蛋白纯化
• 2.4.1 Slit-2条件性培养液收集
• 2.4.2 从Slit-2条件性培养液纯化Slit-2及其功能检测
• 2.5 钙离子成像
• 2.6 原代培养的嗅鞘细胞转染
• 2.7 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 2.7.1 mRNA抽提
• 2.7.2 逆转录（Reverse Transcription,RT）
• 2.7.3 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.8 蛋白质印记法（Western blotting）
• 2.9 组织块培养
• 2.10 实验所用动物、仪器和试剂抗体
• 2.10.1 实验所用动物
• 2.10.2 实验所用仪器
• 2.10.3 实验所用试剂抗体
• 2.11 统计学处理
• 3.实验结果
• 3.1 嗅觉系统发育过程中Slit-2表达于嗅上皮,受体Robo-1表达于嗅鞘细胞
• 3.2 Slit-2排斥嗅鞘细胞迁移
• 3.3 单细胞迁移中Slit-2浓度梯度引起迁移的嗅鞘细胞前导突起塌缩和胞体翻转迁移
• 3.4 钙离子信号介导了Slit-2引起嗅鞘细胞的塌缩和翻转运动
• 3.5 钙离子信号下游RhoA介导了Slit-2引起的嗅鞘细胞胞体的翻转迁移
• 3.6 Slit-2引起的嗅鞘细胞骨架的重排
• 3.7 钙依赖的Cofilin激活介导了Slit-2引发的嗅鞘细胞前导突起的塌缩
• 3.8 F-actin聚合和RhoA抑制剂浓度梯度模拟了Slit-2对嗅鞘细胞迁移的作用
• 4.实验讨论
• 4.1 在嗅觉系统发育过程中,Slit-2对嗅鞘细胞迁移的作用
• 4.2 钙离子信号在Slit-2引起的嗅鞘细胞排除性迁移中作用
• 4.3 Slit-2引起细胞塌缩的分子机制
• 4.4 RhoA在Slit-2引起胞体翻转迁移的作用
• 4.5 Slit-2引起的嗅鞘细胞翻转迁移的信号模型
• 5 结论
• 参考文献
• 文献综述:嗅鞘细胞的生物学特性及功能
• 1.前言
• 2.嗅鞘细胞的发现及归属命名
• 3.嗅鞘细胞在神经系统发育中的起源与发育
• 4.嗅鞘细胞培养
• 4.1 嗅鞘细胞原代培养与纯化
• 4.2 嗅鞘细胞系的建立
• 5.嗅鞘细胞生物学特性
• 5.1 形态学特性
• 5.1.1 在体嗅鞘细胞表面抗原的多样性
• 5.1.2 离体培养的嗅鞘细胞形态多样性
• 5.1.3 嗅鞘细胞形态可塑性
• 5.2 嗅鞘细胞运动学特性
• 5.2.1 嗅鞘细胞在发育过程中的迁移机制
• 5.2.2 离体培养的嗅鞘细胞的迁移机制
• 6.嗅鞘细胞功能
• 6.1 嗅鞘细胞与嗅受体神经元的相互作用
• 6.2 嗅鞘细胞在神经损伤修复中的作用
• 6.2.1 嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的概括
• 6.2.2 嗅鞘细胞促进脊髓损伤修复的可能机制
• 6.2.3 在其它神经系统疾病中的应用
• 7.总结与展望
• 参考文献
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果