COLD-PCR用于混合检材中微量等位基因富集的可行性

论文摘要

背景来自两个或两个以上个体的混合检材是法医物证检验中经常遇到的疑难检材类型之一。随着高灵敏检测技术、高多态性和性连锁等特殊遗传标记的普及应用,从混合检材中获取证据信息的能力不断提高。但即使对于经验丰富的专家来说,实际案件中一些混合检材的检测和结果解释仍然是一个巨大的挑战。如何对组份含量差异较大的混合检材中的少量成份进行分型,是当前法医DNA分析的难题之一。目的建立人类Y染色体M175插入/缺失基因座的COLD-PCR（co-ampLification at lower denaturation temperature PCR）技术,比较COLD-PCR与常规PCR对不同比例混合样品的扩增分型效果,初步探讨COLD-PCR用于法医混合检材中低水平等位基因富集扩增分型的可行性。方法首先建立人Y-M175基因座的常规PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PCR-PAGE）银染法分型技术,调查103名河南汉族男性无关志愿者的基因型。用蛋白酶K消化-酚/氯仿法提取插入和缺失型个体的基因组DNA,按不同比例混合制备成混合样品。用梯度保温异源双链消减法测定M175大扩增子（171/166bp）的临界变性温度（critical denaturation temperature,Tc）,高分辨率熔解率曲线法（high resolution melting analysis,HRM）测定M175短扩增子（91/86bp）的Tc值。以Tc值为基础,通过在常规PCR的变性和退火之间增加扩增产物杂交和异源双链变性两个步骤,分别建立和优化基于PAGE-银染法（大扩增子）和实时定量法（小扩增子）的COLD-PCR技术,比较常规PCR和COLD-PCR对不同比例混合样品的扩增分型效果。结果河南汉族Y-M175基因座插入和缺失型的频率分别为0.1650、0.8350。M175大扩增子的Tc值为76.4℃,小扩增子的Tc值为78.4℃,优化后采用的COLD-PCR异源双链变性温度分别为76.4和78.2℃。大扩增子PAGE-银染法,常规PCR可以有效分型的混合样品的组分比例为5∶1,而COLD-PCR至少可以达到20∶1。小扩增子实时定量法,常规PCR可以有效分型的混合样品的组分比例为16∶1,而COLD-PCR至少可以达到64∶1。结论使用与常规PCR相同的设备和试剂, COLD-PCR能实现混合样品中微量等位基因的富集扩增,扩大可分型混合检材的范围,改进分型效果,在混合检材的法医DNA分型中有潜在应用价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 法医混合检材
• 1.2 法医混合检材鉴定研究现状
• 1.2.1 混合成份分离法
• 1.2.2 性别特异性遗传标记法
• 1.2.3 高多态性遗传标记结合高灵敏检测技术法
• 1.2.4 混合检材中组织细胞成分差异较大的个体的基因分型
• 1.3 COLD-PCR 简介
• 第2章 河南汉族 Y 染色 M175 基因座的遗传多态性
• 2.1 背景
• 2.2 材料
• 2.2.1 仪器
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 试剂配制
• 2.2.4 样本
• 2.3 方法
• 2.3.1 Chelex-100 快速提取法
• 2.3.2 引物设计
• 2.3.3 PCR 扩增
• 2.3.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
• 2.3.5 统计学分析
• 2.4 结果
• 第3章 普通 PCR 仪下使用 COLD-PCR 检测混合检材中的微量成分
• 3.1 背景
• 3.2 材料
• 3.2.1 仪器
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 试剂配制
• 3.2.4 样本
• 3.3 方法
• 3.3.1 Chelex-100 快速提取法
• 3.3.2 蛋白酶K-酚-氯仿提取法
• 3.3.3 浓度检测
• 3.3.4 混合样品准备
• 3.3.5 引物设计
• 3.3.6 Tc 值的测定
• 3.3.7 COLD-PCR 扩增
• 3.3.8 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离COLD-PCR 扩增产物
• 3.4 结果
• 3.4.1 Tc 值
• 3.4.2 COLD-PCR 及与其富集效果
• 第4章 实时定量 PCR 检测技术与 COLD-PCR 结合检测混合检材中的微量成分
• 4.1 背景
• 4.2 材料
• 4.2.1 仪器
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 试剂配制
• 4.2.4 样本
• 4.3 方法
• 4.3.1 蛋白酶K-酚-氯仿提取法
• 4.3.2 混合样品准备
• 4.3.3 引物设计
• 4.3.4 应用实时定量PCR 仪的常规PCR
• 4.3.5 异源双链 Tm 值的HMR 测定
• 4.3.6 COLD-PCR 扩增
• 4.4 结果
• 4.4.1 Y-M175 基因座短扩增子PCR 的建立及Tm 值测定
• 4.4.2 Y-M175 基因座短扩增子异源双链Tm 值及COLD-PCR Tc 值的测定
• 4.4.3 COLD-PCR 及其富集效果
• 第5章 讨论
• 5.1 COLD-PCR 的原理
• 5.2 Tc 值及其测定
• 5.3 COLD-PCR 程序
• 5.4 Y-M175 基因座COLD-PCR 富集分型效果
• 5.5 EvaGreen 荧光染料的选择
• 5.6 法医学应用前景与存在的问题
• 第6章 结论
• 第7章 综述混合检材中的微量等位基因富集技术进展
• 7.1 概要
• 7.2 对已知突变选择性和富集的一般方法
• 7.3 对已知突变有较高选择性和富集的方法
• 7.4 根据突变序列富集未知突变
• 参考文献
• 缩略语词汇表
• 附录A 论文
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果