KLF4在全反式维甲酸和PDGF调节SM22α表达中的作用及机制研究

KLF4在全反式维甲酸和PDGF调节SM22α表达中的作用及机制研究

论文摘要

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)表型转化在动脉粥样硬化和血管再狭窄等血管重塑性疾病的发生发展中起重要作用。正常情况下,血管壁中膜的VSMC呈分化表型,也称收缩表型,表达SMα-actin、SM-MHC和SM22α等平滑肌特异的收缩蛋白。当血管受到损伤因素刺激时,VSMC可从收缩表型转化为合成表型并获得增殖能力,同时SMC特异收缩蛋白的表达被阻抑。虽然VSMC表型转化在血管重塑性疾病的发生发展中发挥重要作用,但目前控制VSMC表型转化的确切分子机制还不是很清楚。因此,阐明VSMC表型转化的分子机制对血管重塑性疾病的防治具有重要意义。平滑肌22 alpha(smooth muscle 22 alpha,SM22α)是VSMC分化标志蛋白之一,因分子量约为2225 kD而得名。全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)是维生素A的衍生物,通过与胞内受体RAR/RXR相互作用而促进细胞分化。血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)是一种强效促有丝分裂剂,通过与细胞膜上的特异性受体PDGFR相互作用而促进细胞增殖。Krüppel样因子(krüppel-like factor,KLF)是一类含有锌指结构的多能转录因子,在细胞增殖、凋亡、分化、胚胎发育以及体细胞重编程中发挥重要作用。近年来的研究结果显示,KLF4作为转录因子可直接与DNA结合调节基因的表达。我室以及Owens等的研究结果证实,ATRA和PDGF-BB均可显著诱导KLF4表达,并且KLF4在ATRA诱导SMC分化标志基因表达以及PDGF-BB阻抑SMC分化标志基因表达中均发挥重要作用。然而,在促增殖和促分化因素作用下,KLF4对SMC分化标志基因表达发挥不同调节作用的机制目前尚不清楚。本文系统研究KLF4在ATRA诱导VSMC分化以及PDGF-BB促进VSMC增殖中的作用及其分子机制。1 KLF4在ATRA诱导VSMC分化以及PDGF-BB促进VSMC增殖中均发挥重要作用本部分实验以VSMC分化和去分化标志基因表达水平作为判断VSMC表型的指标,检测ATRA和PDGF-BB对VSMC增殖以及表型转化的影响。通过敲低和过表达KLF4考察KLF4是否参与ATRA诱导的VSMC分化和PDGF-BB诱导的VSMC增殖。实验结果如下:1.1 ATRA和PDGF-BB对VSMC增殖能力的影响细胞计数和BrdU掺入分析实验结果显示,ATRA能以浓度(5、10、20μM)和时间(12、24、48 h)依赖的方式抑制VSMC增殖,以ATRA浓度为10μM作用于VSMC 48 h的抑制作用最强。PDGF-BB能以浓度(5、10、20 ng/mL)和时间(12、24、48 h)依赖的方式促进VSMC增殖,以PDGF-BB浓度为10 ng/mL作用于VSMC 48 h的促增殖作用最强。1.2 ATRA和PDGF-BB对KLF4和VSMC表型标志基因表达的影响Western blot结果表明,ATRA和PDGF-BB均可显著诱导KLF4表达,并具有明显的时效(12、24、48 h)和量效(5、10、20μM或5、10、20 ng/mL)关系。SM22α表达是VSMC处于分化状态的重要分子标志,PCNA表达是VSMC处于增殖状态的重要分子标志。采用Western blot方法,检查ATRA和PDGF-BB对VSMC表型标志基因表达的影响。结果显示,在ATRA处理的VSMC中,分化标志基因SM22α表达明显升高,增殖标志物PCNA表达显著降低;然而,在PDGF-BB处理的VSMC中,SM22α的表达明显降低,PCNA表达显著升高。1.3敲低或过表达KLF4对VSMC分化标志基因表达以及应力纤维形成的影响将靶向KLF4的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)导入VSMC,阻断内源性KLF4表达后,研究KLF4在ATRA诱导VSMC分化以及PDGF-BB诱导VSMC增殖中的作用。首先我们证实,转染KLF4-siRNA可使KLF4蛋白表达水平降低7580%,表明该基因的表达被有效敲低。Western blot与鬼笔环肽染色结果表明,在ATRA刺激下,转染KLF4-siRNA的VSMC中SM22α表达较对照siRNA的细胞明显降低,同时,应力纤维的形成也明显减少;在PDGF-BB刺激下,转染KLF4-siRNA的VSMC中SM22α表达明显升高,同时,应力纤维的形成也稍有增加。另外,将KLF4腺病毒表达载体Ad-KLF4感染VSMC,观察强制表达KLF4对SM22α表达和应力纤维形成的影响。Western blot与鬼笔环肽染色结果显示,在KLF4过表达的VSMC中,SM22α表达以及应力纤维的形成明显高于转染空载体的对照组。2在不同因素作用下,KLF4以乙酰化/脱乙酰化依赖的方式对SM22α的转录激活发挥不同的调节作用KLF4的转录活性受许多因素的调节,包括与其相互作用的辅助因子或其本身的修饰状态,例如乙酰化、磷酸化、甲基化等多种修饰方式。本部分实验观察ATRA和PDGF-BB对KLF4乙酰化修饰的影响,探讨KLF4乙酰化在调节SM22α表达中的作用。2.1 ATRA促进而PDGF-BB抑制KLF4与SM22α启动子结合SM22α启动子区存在两个KLF4结合位点(以下称为site 1和site 2),染色质免疫沉淀(ChIP)和Oligonucleotide pull down实验证明,ATRA促进KLF4与site 2结合,PDGF-BB抑制KLF4与site 1结合。2.2 KLF4通过不同结合位点,以乙酰化依赖的方式调节SM22α启动子活性接下来,我们进一步确定KLF4与两个位点的结合活性是否受其乙酰化水平的影响。Western blot结果显示,ATRA刺激使KLF4乙酰化水平显著增加,PDGF-BB刺激使KLF4乙酰化水平显著下降。Oligonucleotide pull down实验证明,ATRA促进乙酰化型KLF4与site 2结合,PDGF-BB促进KLF4脱乙酰化,使KLF4与site 1结合减少。2.3组蛋白乙酰转移酶p300使KLF4发生乙酰化修饰报告基因分析结果显示, KLF4与p300共转染可以协同激活SM22α启动子指导的报告基因,当KLF4乙酰化位点发生突变后,无论p300存在与否都不能增强SM22α的启动子活性。体外乙酰化分析结果证明,在acetyl-CoA存在的条件下,纯化的GST-KLF4可以被GST-p300-HAT (p300的活性结构域)乙酰化。用GST-KLF4纯品进行Oligonucleotide pull down实验的结果显示,KLF4被乙酰化修饰后,与site 1和site 2的结合能力增加。上述结果证明,在ATRA刺激下,KLF4发生乙酰化修饰,乙酰化型KLF4与SM22α启动子区site 2的结合增加,促进SM22α转录;相反,在PDGF-BB刺激下,部分KLF4分子发生脱乙酰化,KLF4与SM22α启动子区site 1的结合减少,从而抑制SM22α的转录。3 ATRA通过激活JNK和p38信号通路诱导KLF4乙酰化,PDGF-BB通过激活ERK和PI3K/Akt信号通路诱导KLF4脱乙酰化为了进一步研究KLF4介导ATRA和PDGF-BB调节SM22α表达的分子机制,本部分实验探讨ATRA和PDGF-BB对JNK、p38、ERK和PI3K/Akt信号通路的影响。3.1 ATRA通过激活JNK和p38信号途径诱导KLF4乙酰化,PDGF-BB通过激活ERK和PI3K/Akt信号途径诱导KLF4脱乙酰化VSMC分别经ATRA(10μM)或PDGF-BB(10 ng/mL)刺激15、30、60 min,用乙酰化赖氨酸抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀后检测乙酰化型KLF4的水平,结果显示,随着ATRA刺激时间的延长,乙酰化型KLF4水平逐渐升高,同时,ATRA刺激后,JNK和p38的磷酸化水平也显著升高,而ERK磷酸化水平则显著降低,Akt磷酸化水平没有明显变化;随着PDGF-BB刺激时间的延长,乙酰化型KLF4水平逐渐降低,同时,PDGF-BB刺激使JNK、p38、ERK、Akt的磷酸化水平均明显升高。分别以JNK特异性抑制剂SP600125、p38特异性抑制剂SB203580、ERK特异性抑制剂PD98059和Akt特异性抑制剂LY294002处理VSMC,特异性阻断JNK、p38、ERK或Akt活化后,再以10μM ATRA或10 ng/mL PDGF-BB处理细胞。Western blot结果显示,SP600125或SB203580预处理细胞可显著抑制ATRA诱导的KLF4乙酰化。用靶向JNK或p38的siRNA敲低内源性JNK或p38表达后,ATRA对KLF4乙酰化不再产生明显影响。证明ATRA诱导的KLF4乙酰化依赖于JNK和p38信号途径的激活。PD98059或LY294002预处理细胞可显著抑制PDGF-BB诱导的KLF4脱乙酰化,SP600125和SB203580对PDGF-BB诱导的KLF4脱乙酰化没有明显影响。用靶向ERK或PI3K/Akt的siRNA敲低内源性ERK或PI3K/Akt表达后,PDGF-BB对KLF4的乙酰化水平不再产生影响。证明PDGF-BB诱导的KLF4脱乙酰化依赖于ERK和PI3K/Akt信号途径的激活。为了进一步确定ATRA和PDGF-BB是否通过调节KLF4乙酰化水平改变其与SM22α启动子的结合活性,我们进行了Oligonucleotide pull down分析。结果表明,用JNK特异性抑制剂SP600125或p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞,或用靶向JNK或p38的siRNA敲低内源性JNK或p38表达后,可明显抑制ATRA诱导的KLF4与site 2结合,而对KLF4与site 1的结合无明显影响。用ERK特异性抑制剂PD98059或Akt特异性抑制剂LY294002预处理细胞,或用靶向ERK或PI3K/Akt的siRNA敲低内源性ERK或PI3K/Akt表达后,能有效防止PDGF-BB诱导的KLF4与site 1解离,但对KLF4与site 2的结合无明显影响。3.2 ATRA通过激活JNK和p38信号通路诱导KLF4磷酸化以及KLF4与p300的相互作用,PDGF-BB通过激活ERK和PI3K/Akt信号通路诱导KLF4脱磷酸化以及KLF4与HDAC2的相互作用为了进一步明确ATRA和PDGF-BB诱导的KLF4乙酰化改变是否依赖于KLF4磷酸化,我们进一步检测ATRA和PDGF-BB对KLF4磷酸化的影响。Western blot结果表明,ATRA时间依赖性的增加KLF4的磷酸化水平,而PDGF-BB时间依赖性的促进KLF4脱磷酸化。用SP600125、SB203580、PD98059或LY294002预处理细胞,特异性的阻断JNK、p38、ERK或PI3K/Akt信号通路的活化,再以10μM ATRA或10 ng/mL PDGF-BB处理细胞。Western blot结果表明,SP600125或SB203580预处理细胞可显著抑制ATRA诱导的KLF4磷酸化。用靶向JNK或p38的siRNA敲低内源性JNK或p38表达后,ATRA对KLF4磷酸化不再产生明显影响。证明ATRA诱导的KLF4磷酸化依赖于JNK和p38信号途径的激活。PD98059或LY294002预处理细胞可显著抑制PDGF-BB诱导的KLF4脱磷酸化,SP600125和SB203580对PDGF-BB诱导的KLF4脱磷酸化没有明显影响。用靶向ERK或PI3K/Akt的siRNA敲低内源性ERK或PI3K/Akt表达后,PDGF-BB对KLF4的磷酸化水平不再产生影响。证明PDGF-BB诱导的KLF4脱磷酸化依赖于ERK和PI3K/Akt信号途径的激活。为了观察KLF4磷酸化是否影响其与p300和HDAC2相互作用,我们还进行了免疫共沉淀分析。结果表明,在SP600125或SB203580预处理的细胞中,给予ATRA刺激后,KLF4与p300的相互作用明显减少,与HDAC2的相互作用明显增加;在PD98059或LY294002预处理的细胞中,给予PDGF-BB刺激后,KLF4与p300的相互作用明显增加,而与HDAC2的相互作用明显减少,交互免疫沉淀也得到了相似的结果。用靶向JNK、p38、ERK或Akt的siRNA敲低内源性JNK、p38、ERK或Akt表达后,无论是ATRA还是PDGF-BB对KLF4与p300或HDAC2的相互作用均不再产生明显影响。上述结果表明,ATRA通过JNK和p38信号通路诱导KLF4发生磷酸化修饰,磷酸化型KLF4与p300的结合活性增加,结果表现为KLF4发生乙酰化修饰;PDGF-BB通过ERK和PI3K/Akt信号通路诱导KLF4脱磷酸化,脱磷酸化型KLF4与HDAC2的结合活性增加,表现为KLF4脱乙酰化。结论1 KLF4在ATRA诱导以及PDGF-BB抑制SM22α的表达中均发挥重要作用。2在ATRA和PDGF-BB作用下,KLF4通过与SM22α启动子区不同的结合位点结合,以乙酰化/脱乙酰化依赖的方式调节SM22α基因表达。3 ATRA通过激活JNK和p38信号通路诱导KLF4乙酰化,乙酰化型KLF4与SM22α启动子区KLF4结合位点2(-136-132, GTGGG)结合活性增加,激活SM22α的表达;PDGF-BB通过ERK和PI3K/Akt信号通路诱导KLF4脱乙酰化,使KLF4与SM22α启动子区KLF4结合位点1(-263-259, CACCC)的结合减少,从而抑制SM22α的表达。4 ATRA通过激活JNK和p38信号通路诱导KLF4磷酸化以及KLF4与p300相互作用,PDGF-BB通过激活ERK和PI3K/Akt信号通路诱导KLF4脱磷酸化以及KLF4与HDAC2相互作用。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 英文缩写
  • 引言
  • 第一部分 KLF4 在ATRA 诱导VSMC 分化以及PDGF-BB 促进VSMC增殖中均发挥重要作用
  • 前言
  • 材料与方法
  • 结果
  • 附图
  • 讨论
  • 小结
  • 参考文献
  • 第二部分 在不同刺激因素作用下,KLF4 以乙酰化/脱乙酰化依赖的方式对 SM22α 的转录激活发挥不同的调节作用
  • 前言
  • 材料与方法
  • 结果
  • 附图
  • 讨论
  • 小结
  • 参考文献
  • 第三部分 ATRA 通过激活 JNK 和 p38 信号通路诱导 KLF4 乙酰化,PDGF-BB 通过激活 ERK 和 PI3K/Akt 信号通路诱导KLF4 脱乙酰化
  • 前言
  • 材料与方法
  • 结果
  • 附图
  • 讨论
  • 小结
  • 参考文献
  • 结论
  • 综述
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简历
  • 相关论文文献

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