论文摘要
聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,它的发现和发展对生物学领域具有深远的意义。PCR反应中至关重要的部分是引物设计,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。传统的PCR引物设计方法仅仅考虑了引物的长度、Tm值和GC含量等因素,而忽略了聚合酶对不同序列引物／模板DNA的亲和性,也即聚合酶与引物／模板的结合自由能的大小。为了提高PCR引物设计的效率,为引物设计提供新的更可靠的方法,本文提出了基于能量计算进行引物设计的方法。为了验证基于能量进行引物设计方法的可靠性,本文将该方法应用到了实验室比较容易扩增的HSA基因上,结果表明,基于能量计算结果在结合能较低的位点设计的5对引物的PCR效率(包括PCR产物的量及引物的特异性)普遍高于在结合能较高的位点设计的5对引物的效率,这说明聚合酶与引物/模板DNA的相互作用确实对PCR的效率有影响,而且与聚合酶的结合能较低的引物,其PCR效率普遍偏高。对于实验室比较难扩增的PyrF基因,基于能量计算结果在结合能较低的位点设计出来的3对引物的效率明显高于普通引物设计软件推荐出的最优引物,该结果印证了上述结果的可靠性。同时,本文采用基于结构的分子动力学模拟方法(SBM)对Taq DNA聚合酶与引物/模板DNA进行了分子动力学模拟,成功地得到了Taq DNA聚合酶与引物/模板DNA由open状态到closed状态的反应轨迹,有助于我们深入理解聚合酶与引物/模板DNA相互作用的机制。综上所述,基于能量计算结果进行引物设计的方法确实可以提高引物设计的效率,这提示我们DNA聚合酶与引物/模板的结合自由能可以作为PCR引物设计的新的参考指标,有助于帮助我们设计出更加高效的引物。