论文摘要
背景百草枯（paraquat，PQ），国内商品名为克无踪。其中毒引起的病死率很高，国外报道病死率为40％～50％，而国内个别报道高达80％以上。百草枯进入人体可使肺、肾、肝和肾上腺出现损伤，而其中毒的特征性改变是肺损伤，表现为早期肺泡上皮细胞受损，肺泡内出血水肿，炎症细胞浸润，晚期则出现肺泡内和肺间质纤维化，这种表现被命名为“百草枯肺”，是急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的一种变异形式，也是PQ中毒患者的主要死亡原因。而近年来，肺纤维化机制研究取得了许多非常重要的进展，特别是肺内的多种类型细胞以及细胞因子在这一复杂过程中所起的作用引人注目，从而提出了肺细胞及细胞因子网络的概念。肺泡巨噬细胞及其他肺结构细胞合成的各种细胞因子如转化生长-β（transforming growth factor-beta，TGF-β），肿瘤坏死因子（tumor neciosis factor，TNF-α），血小板源性生长因子（platelete rived growthfactor，PDGF），胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1），白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）等在肺纤维化机制研究中取得了非常重要的进展。有资料证明，TGF-β1在肺纤维化的形成与发展中起关键性作用。研究发现，肺泡炎渗出液中有多种细胞生长因子，它们表达的种类、作用浓度和高表达的时间差异以及其相应受体激活程度，对肺泡上皮修复或肺纤维化的发生至关重要，其中TGF-β1是人们关注的热点之一。目的1．探讨百草枯中毒的作用机制。2．观察细胞因子在百草枯中毒所致的急性反应过程中所表现出变化规律。3．通过对（2）的实验观察的结果，继续追踪细胞因子TGF—βmRNA的规律，探讨百草枯中毒分子水平的机制。4．通过实验病理观察百草枯中毒肺纤维化变化的规律。方法1．百草枯中毒动物模型的制备：健康Wistar大鼠24只，雌雄各半，适应性饲养一周后，随机分为对照组、染毒3天组、7天组和21天组，染毒组按60mg／kg剂量比配置百草枯悬液染毒，染毒组给予相应剂量的百草枯溶液1ml灌胃，对照组同时给予1ml蒸馏水，实验分3天、7天和21天三个时间段进行观察。2．主要试剂及药品：体积分数为20％的百草枯溶液，英国捷利康有限公司农药部生产；PCR测定需标本存储液及测定试剂盒由宝生物工程（大连）有限公司TaKaRa Biotechnology（Dalian）Co．，Ltd．提供；PDGF、IGF-1、TGF-β1试剂盒，美国R＆D公司进口分装，上海森雄科技实业有限公司提供。3．观察指标：各染毒组动物均于观察结束后采用下腔静脉穿刺取血约5ml，静置20min，离心后取血清，-70℃冻存，待检测，死亡动物于频死前采血，取左肺上叶，冰盐水洗涤后置于由大连宝生物提供标本存储液中封存，待RT-PCR组织检测。血清TGF-β1、PDGF、IGF-1浓度采用酶联免疫吸附法（ELISA），按说明书规程操作。肺组织病理学的检查：取右下肺组织，置于体积分数为10％的甲醛溶液中固定，石蜡包埋切片，苏木精—伊红（HE）染色，光镜观察。结果1．血清细胞因子TGF-β1 3天组较之对照组明显升高，有统计学意义（P＜0.01）7天及21天组有下降但仍居高值，与对照组相比较有统计学意义（P＜0.05），肺组织中RT-PCR定量表达中可看出3天、7天组与对照组比较有升高，有统计学意义（P＜0.05），21天各组与对照组比较有升高但无统计学意义。2．病理：7天以后，肺泡腔内渗出液开始机化，纤维细胞肥大，分泌纤细的胶原纤维，形成较纤细的纤维组织，可见到肺泡腔内纤维化的图像。由于肺泡上皮损伤，其中Ⅱ型细胞的损伤使表面活性物质缺乏，出现肺泡塌陷。肺泡腔内胶原纤维的出现及肺泡塌陷，形成了塌陷性纤维化。以上病变在两周后明显，再以后，肺泡腔内渗出物的纤维化、肺泡及肺泡管透明膜的机化、肺泡隔纤维化进行性进展。（本标本病理切片作了胶原纤维化染色，绿色部分均为肺间质纤维化表现）。结论在百草枯中毒致肺纤维化发病过程中，TGF-β1存在规律性变化，百草枯染毒后血清中TGF-β1明显升高，至21天后仍维持在较高水平。而肺组织TGF-β1 mRNA表达染毒后3天和7天均明显增多，而至21天则出现下降的趋势。这一点与临床上观察到的百草枯中毒病程相符合，说明在百草枯中毒过程中TGF-β1可能起到重要作用，然而其作用的详细机制有待进一步探讨。背景百草枯（paraquat，PQ），国内商品名为克无踪。其中毒引起的病死率很高，国外报道病死率为40％～50％，而国内个别报道高达80％以上。百草枯进入人体可使肺、肾、肝和肾上腺出现损伤，而其中毒的特征性改变是肺损伤，表现为早期肺泡上皮细胞受损，肺泡内出血水肿，炎症细胞浸润，晚期则出现肺泡内和肺间质纤维化，这种表现被命名为“百草枯肺”，是急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的一种变异形式，也是PQ中毒患者的主要死亡原因。而近年来，肺纤维化机制研究取得了许多非常重要的进展，特别是肺内的多种类型细胞以及细胞因子在这一复杂过程中所起的作用引人注目，从而提出了肺细胞及细胞因子网络的概念。肺泡巨噬细胞及其他肺结构细胞合成的各种细胞因子如转化生长-β（transforming growth factor-beta，TGF-β），肿瘤坏死因子（tumor neciosis factor，TNF-α），血小板源性生长因子（platelete rived growthfactor，PDGF），胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1），白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）等在肺纤维化机制研究中取得了非常重要的进展。目的1．探讨百草枯中毒的作用机制。2．观察细胞因子在百草枯中毒所致的急性反应过程中所表现出变化规律。3．通过试验病理观察百草枯中毒肺纤维化变化的规律。方法1．健康Wistar大鼠72只，雌雄各半，适应性饲养一周后，随机分为对照组、高剂量染毒组（120mg／kg）、中剂量染毒组（60mg／kg）和低剂量染毒组（30mg／kg），每组6只大鼠。染毒组给予相应剂量的百草枯溶液1ml灌胃，对照组给同时给予1ml蒸馏水，实验分8h、24h、72h三个时间段进行观察。2．主要试剂及药品：体积分数为20％的百草枯溶液，英国捷利康有限公司农药部生产；PDGF、IGF-1、TGF-β1试剂盒，美国R＆D公司进口分装，上海森雄科技实业有限公司提供。3．观察指标：各染毒组动物均于观察结束后采用下腔静脉穿刺取血约5ml，静置20min，离心后取血清，-70℃冻存，待检测，死亡动物于频死前采血。血清TGF-β1、PDGF、IGF-1浓度采用酶联免疫吸附法（ELISA），按说明书规程操作。肺组织病理学的检查：取右下肺组织，置于体积分数为10％的甲醛溶液中固定，石蜡包埋切片，苏木精—伊红（HE）染色，光镜观察。结果1．8h、24h、72h各剂量组细胞因子的水平在增加，如表1所示，24h与72h组与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05or P＜0.01）。72h高剂量组各指标与同时间点低剂量组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。72h高、中、低三个剂量组与8h时间点比较差异有统计学意义（P＜0.05）。研究发现，随染毒浓度的增加细胞因子水平在逐渐增加，随时间的延长细胞因子的水平也在逐渐增加，存在有一定的线性趋势，在整个试验过程中表现出动态的变化。2．病理检查示染毒后8h出现肺泡毛细血管扩张、充血、中性白细胞浸润，24h肺泡毛细血管扩张及炎性粒细胞浸润更加明显，有大量渗出液；72h出现广泛弥漫的间质纤维化的表现。结论研究发现，随染毒浓度的增加，细胞因子水平也在逐渐增加。随时间的延长8h、24h、72h，细胞因子的水平也在逐渐增加，存在有一定的线性趋势，在整个试验过程中表现出动态的变化。在百草枯中毒急性肺损伤（ALI）机制中细胞因子PDGF、IGF-1、TGF-β1可能起到了重要作用。