论文摘要
第一部分：背景：胸主动脉扩张性疾病包括胸主动脉夹层（thoracic aortic dissection TAD）和胸主动脉瘤（thoracic aortic aneurysm TAA）,是严重危害人类健康的疾病。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase MMP）分解包括弹力蛋白与胶原纤维在内的细胞外基质蛋白（extracellular matrix ECM）,破坏主动脉壁正常的层状结构,最终导致主动脉壁的退化、扩张与破裂。转化生长因子-β（Transforming growth factor-βTGF-β）家族是一类多功能的细胞因子家族,他们通过细胞内的Smad转录因子对细胞发挥调节作用。许多研究表明异常的TGF-p信号转导和主动脉夹层发病有关。目的：研究TGF-β1对血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell VSMC）产生MMP的调控作用。方法：取SD大鼠的胸主动脉,原代培养血管平滑肌细胞。免疫细胞化学法鉴定其纯度。用不同浓度（0、1、5、10ng/ml）的TGF-β1干预VSMC,分别在要求的时间（0、2、4、6、16、24小时）提取培养基上清和裂解细胞提取蛋白、提取总RNA。测定RNA浓度和蛋白质浓度。明胶酶谱法检测培养基中蛋白酶的活性,Western Blot检测细胞中MMP9的表达,RT-PCR检测MMP9基因的表达。结果：原代培养的VSMC在传代第4代后纯度可达90%以上。MMP9的酶活性和蛋白质表达随TGF-β1浓度增加和时间的延长而增加,其中10ng/ml刺激24小时后升高最明显,MMP2的活性和蛋白质表达却无明显改变。MMP9基因随时间的延长而表达增加,其中刺激6小时后表达就已经显著升高。结论：lOng/ml的TGF-β1刺激血管平滑肌细胞24小时后能产生并分泌大量的MMP9,这种改变发生在转录水平。第二部分背景：活性氧（reactive oxygen species, ROS）是由氧形成的几种活性物质的总称,氧化应激是指组织或细胞中氧自由基增多或清除能力降低导致ROS在体内或细胞内增多而引起的氧化损伤过程。众所周知,氧化应激（oxidative stress）与心血管疾病关系密切,是主动脉瘤、高脂血症、高血压和糖尿病、动脉粥样硬化的共同机制之一。研究表明氧化应激在主动脉夹层的发生过程中具有重要作用,主动脉瘤的动物模型中,基因水平或药物抑制ROS的产生可以抑制主动脉瘤的形成。目的：研究ROS在TGF-β1刺激血管平滑肌细胞产生MMP9的过程中是否发挥作用。方法：按照设计的不同浓度给予N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）预作用VSMC1小时,再给予10ng/m1的TGF-β1作用24小时。提取培养基上清,明胶酶谱法检测培养基中蛋白酶的活性,裂解细胞提取蛋白检测细胞中Western Blot检测细胞中MMP9的表达。VSMC接种于六孔板,原位装载DCFH-DA探针,样本分为A,B二组,A组：给予lOng/ml TGF-β1,B组：给予NAC （5mM）预作用1小时后再给予同等浓度的TGF-β1干预,用酶标仪观测3-240min的荧光强度,并在倒置荧光显微镜下观察并拍照。取无血清同步后的VSMC,给予或者不给予NAC（5mM）预作用后,分别给予不同浓度的H2O2（?）（?）TGF-β1作用24小时,然后提取培养基上清明胶酶谱法检测培养基中蛋白酶的活性,并裂解细胞提取蛋白,Western Blot检测细胞中MMP9的表达。结果：5mM NAC明显的抑制了TGF-β1刺激血管平滑肌细胞MMP9表达和分泌的增高。TGF-β1刺激使平滑肌细胞内ROS明显增加,30分钟就达到高峰,而NAC预作用后再给予TGF-β1则ROS不会明显增高。1mM H2O2会刺激VSMC表达和分泌MMP9的显著增高,但是这种改变可以被NAC（5mM）完全抑制。结论：TGF-β1刺激VSMC表达和分泌MMP9的过程是由细胞内活性氧参与的。第三部分背景：丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路是众多信号转导通路的一种,其激活调控一系列细胞活动,在信息由胞外传到核内的的过程中发挥很重要的作用。目前已知四条丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路,细胞外调节蛋白激酶（Extracellular signal-regulated kinases1and2ERK1/2）转导通路是其中发现最早,也是研究最透彻的一条。ERK信号通路广泛参与了心血管系统细胞增殖、分化、迁移的调节。有研究报导人类腹主动脉瘤组织中已经发现了较正常组织中明显增高的MEK1/2和ERK1/2磷酸化水平。目的：研究MAPK/ERK通路在TGF-β1刺激血管平滑肌细胞产生MMP9的过程中是否发挥作用。方法：给予不同浓度U0126预作用VSMC1（?）、时,再给予10ng/ml的TGF-β1作用24小时。提取培养基上清明胶酶谱法检测培养基中蛋白酶的活性,裂解细胞提取蛋白,Western Blot检测细胞中MMP9的表达。给予10ng/ml的TGF-β1作用,分别在指定的时间（0、3、5、10、15、30min）提取蛋白,用相应的磷酸化抗体C-Raf,MEK1/2,ERK1/2,P90RSK做Western Blot检测相关蛋白磷酸化的表达。给予不同的抑制剂（NAC或者U0126）预作用1小时,再给与10ng/ml的TGF-β1作用,10min后用磷酸化蛋白提取试剂盒提取蛋白,用C-Raf,ERK1/2抗体检测相应抗原的表达。结果：10uM U0126显著抑制TGF-β1刺激血管平滑肌细胞MMP9表达和分泌的增高。TGF-β1刺激VSMC,细胞内信号通路蛋白C-Raf,MEK1/2,ERK1/2,P90-RSK的磷酸化均在很短时间内发生,并且在10min左右达顶峰。给予特异性抑制剂NAC（5mM）,U0126（10uM）预干预后,再给予的TGF-β1刺激,见C-Raf的磷酸化只被NAC抑制,ERK1/2的磷酸化则被二者完全抑制。结论：TGF-β1刺激VSMC表达和分泌MMP9的过程是由依赖ROS的MAPK/ERK信号通路参加的。第四部分背景：NF-κB是以二聚体形式存在于胞内的转录因子,存在于自然界几乎所有真核细胞中,参与多种基因的表达调控,影响着细胞的生长、分化、凋亡等多种生物学功能。众多的研究都提示了NF-κB激活,导致MMP-9表达增高在主动脉瘤和主动脉夹层的发病中起了重要作用。目的：研究NF-κB通路在TGF-β1刺激血管平滑肌细胞产生MMP9的过程中是否发挥作用。方法：给予不同浓度Bay11-7082预作用VSMC1小时,再给予TGF-β1作用24小时。提取培养基上清明胶酶谱法检测培养基中蛋白酶的活性,裂解细胞提取蛋白,Western Blot检测细胞中MMP9的表达。给予10ng/ml的TGF-β1作用,分别在指定的时间（0、1/4、1/2、1、2、4hour）提取蛋白,用相应的P65磷酸化抗体做Western Blot检测相关蛋白磷酸化的表达。给予不同的抑制剂（NAC.U0126或者Bayll-7082）预作用1小时,再给TGF-β1作用,1小时后提取蛋白,用P65磷酸化抗体检测相应抗原的表达。给予抑制剂Bayll-7082（1uM）预作用1小时,再给予TGF-β1作用,10min后提取蛋白,用ERK1/2磷酸化抗体检测相应抗原的表达。结果：1uM Bay11-7082显著抑制TGF-β1刺激血管平滑肌细胞MMP9表达和分泌的增高。TGF-β1刺激VSMC,NF-κB的磷酸化随着时间延长逐渐明显,并且在1小时左右达顶峰。给予特异性抑制剂U0126（10uM）.NAC（5mM）, Bay11-7082（1uM）预干预后,再给予的TGF-β1刺激,NF-κB的磷酸化被完全抑制。Bay11-7082（1uM）预干预后,冉给予lOng/ml TGF-β1刺激,ERK1/2仍有磷酸化改变。结论：TGF-β1刺激血管平滑肌细胞表达MMP9的过程是由依赖ROS的ERK-NF-κB信号通路参加的。本研究发现了血管平滑肌细胞中一条新的调节通路,并且有可能为将来找到治疗TAA、TAD新的方法提供帮助。
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标签：转化生长因子论文; 基质金属蛋白酶论文; 血管平滑肌细胞论文; 细胞内活性氧论文; 细胞外调节蛋白激酶论文; 核转录因子论文;