蛇源去整合素Adinbitor对Integrin αvβ3信号转导通路的影响

论文摘要

蛇毒是自然界最复杂的天然毒性蛋白混合物之一,具有非常广泛的生物活性,很早就引起国内外科学工作者的注意。去整合素（disintegrins）为一组源自于出血性蛇毒的抗黏附蛋白质的总称,因其可强力拮抗整合素（integrin）而得名。其特征为:富含半胱氨酸,并多含有Arg-Gly-Asp （RGD）或Lys-Gly-Asp（KGD）亲水性氨基酸序列,分子量仅为59 kD,多为单链蛋白分子。此蛇毒蛋白家族可凭借其分子中RGD序列而成为细胞外基质（ECM）与细胞整合素间结合的强有力的竞争性拮抗剂;因RGD模体能被血小板纤维蛋白原受体αIIbβ3识别,其还具有抑制ADP诱导的血小板聚集的作用。因此,去整合素可运用于与细胞黏附相关的疾病研究领域,如血管新生、肿瘤转移、血栓症等。关于去整合素的功能研究,国内外已有的相关报道为:台湾的Rhodostomin[1]和Accutin[2]、韩国的Salmosin[3,4]和Saxatilin[5]、美国的Contortrostatin[6]等,这些取自于蛇毒的去整合素均具有抑制血管新生与肿瘤转移,抑制血小板聚集等功效[1-9]。整合素为一细胞表面受体的异源二聚体家族,是一组跨膜糖蛋白,迄今为止已知有18种不同的α亚基和8种不同的β亚基组成至少24种的异源二聚体[11-12]。α及β亚基的N末端（胞外端）共同构成配体结合位点。因为大部分细胞整合素都识别RGD氨基酸顺序,而大多数ECM蛋白都含有RGD顺序,所以RGD序列已被公认为是ECM成分与细胞整合素结合的位点[13]。整合素胞内部分较短,但可以通过α-辅肌动蛋白（α-actinin）、踝蛋白（talin）和黏着斑蛋白（vinculin）与细胞骨架相连。整合素主要介导细胞之间及细胞与ECM之间的黏附,并介导细胞与ECM之间的双向信号传导,对细胞的黏附、增殖、分化、转移、凋亡起到重要的调控作用,在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用[14]。整合素αVβ3是其中的一种重要分子。许多研究表明,整合素αVβ3与肿瘤侵袭转移有关。在整合素活化和聚集成簇的位点,蛋白质聚集成黏着斑复合体而与细胞内表面相连。这些复合体是细胞应答周围环境而产生张力的位点,其可以使细胞改变形状并实现复杂的细胞迁移和细胞分裂等过程[10]。目前看来,整合素的主要信号转导途径是酪氨酸磷酸化级联反应。整合素αVβ3与配体结合后,早期是通过使黏着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）酪氨酸磷酸化而使其激活,活化的FAK激活胞内多条信号转导通路,如JNK、p38MAPK、Ras-MAPK。引发其他细胞骨架蛋白和信号蛋白的酪氨酸磷酸化,这些磷酸蛋白对调节细胞功能起重要作用。因此,FAK被认为是整合素依赖性信号转导通路的基础分子,在整合素介导的信号转导通路中起着至关重要的作用[15];整合素αVβ3与配体结合后,还可激活整合素连接激酶（ILK）,促进细胞周期循环的进行,抑制细胞的凋亡[16]。目前研究较清楚的是Ras-MAPK通路。FAK有6个磷酸化位点（Tyr397,407,576,577,681,925）,它们是FAK发挥传导功能的关键部位[17]。FAK自身磷酸化位点与Src家族相互作用,使体外FAK激酶活性增加到最大限度,出现Grb2活性位点,再与SOS结合,进入Ras-MAPK通路[18]。由此可见,阻断整合素的信号转导通路,将引起一系列细胞生理活动的改变。而蛇源去整合素因其可强力拮抗整合素无疑会在其中扮演重要角色。鉴于以往对整合素功能及作用机制的相关报道,本文对产于中国旅顺的白眉蝮蛇去整合素进行了研究。本实验室已经从产于中国旅顺的白眉蝮蛇（Gloydius blomhoffi brevicaudus）毒腺中提取出总RNA,利用自行设计的引物进行RT-PCR扩增,获得了219bp的白眉蝮蛇去整合素基因。测序结果显示,其与韩国的蝮蛇去整合素的saxatilin的同源性最高:DNA序列同源性为95.8%,蛋白质序列同源性为91.8%,且蛋白质中含有去整合素的特征模体RGD及12个半胱氨酸。将此去整合素基因进行克隆、转化与诱导后,得到了该蛋白的可溶性高效表达。经组氨酸亲和层析纯化,获得了分子量为9kD的均质蛋白,并将其命名为Adinbitor。本文在上述研究成果的基础上,对蛇源去整合素Adinbitor的作用机制进行了初步探讨。主要做了以下几方面的工作:1.将已成功构建的重组表达菌BL21/pET23b-adinbitor进行IPTG诱导表达;将可溶性蛋白成分经组氨酸亲和层析柱对其进行纯化,行Tricine-SDS PAGE对蛋白鉴定,成功获得了分子量为9kD的均质蛋白rAdinbitor。每升诱导培养物可获3.6mg纯化的rAdinbitor。2 . rAdinbitor剂量依赖性抑制C6细胞增殖的试验结果表明:rAdinbitor与抗αVβ3单克隆抗体的作用类似,提示rAdinbitor的作用位点可能是整合素αVβ3;rAdinbitor抑制C6细胞增殖的半数抑制浓度（median inhibitory concentration ,IC50 ）为2.75μmol/L。rAdinbitor作用C6细胞的Caspase-3 （胱天蛋白酶-3）??细胞凋亡蛋白水解酶表达量分析,rAdinbitor很可能通过Caspase-3途径诱导C6细胞发生凋亡。3.通过rAdinbitor对FAK-Ras-MAPK信号转导通路中FAK、Ras、MEK、ERK各激酶表达及磷酸化的结果表明, rAdinbitor可有效抑制FAK表达及磷酸化;对Ras的表达成促进作用;而对MEK、ERK的表达则为剂量性抑制作用。这充分证明rAdinbitor的信号转导途径是通过抑制整合素αVβ3的信号转导来实现的,通过封闭ECM与整合素的作用位点,阻止黏着斑形成对整合素的信号转导通路起阻滞作用,进而引起细胞凋亡等一系列反应。总之,本论文成功获得了rAdinbitor纯化蛋白,并较为系统的对FAK-Ras-MAPK信号转导通路进行了研究。实验结果提示了蛇源去整合素Adinbitor作为一种抗肿瘤或抗血栓新药的潜在应用价值,并为临床治疗肿瘤开辟新思路和提供新的药物作用靶点。

论文目录

• 一、论文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 第一章 去整合素 Adinbitor 的诱导表达、鉴定与纯化
• （五） 第二章 rAdinbitor 对 Ras-MAPK 信号转导通路的影响
• （六） 结论
• （七） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢