论文摘要
研究目的宫颈癌（cervical cancer）是最常见的妇科恶性肿瘤,放射治疗一直是中晚期宫颈鳞癌患者主要的治疗手段,虽然目前采用了中子照射、组织间腔内治疗等治疗新技术,但仍有30%40%的患者治疗失败,其主要原因是局部复发和远处转移。放射治疗失败的主要原因是肿瘤中心乏氧细胞对放疗不敏感,常规放疗剂量不能完全消灭肿瘤细胞,残存的肿瘤细胞通过加速再增殖很快复发,有多种基因参与这一过程,其中缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor lα,HIF-1α）起关键作用,HIF-1α是一个在缺氧状态下发挥活性的核转录因子,在多种肿瘤组织中高表达。很多因素都对HIF-1α有调控作用,其中缺氧是其主要的调控因素之一。但其具体的调控机制尚不十分清楚。Eag1钾离子通道属电压门控性钾通道,含6个跨膜区（S1S6）的单孔通道,通过去极化而激活。正常情况下其分布十分局限,专一分布于大脑,仅在成肌细胞（即将融合前）和胎盘中有少量表达,但在多种肿瘤中存在高表达。目前认为Eag1通道形成的四聚体中的每一个单体有六个假定的主要包含电压传感蛋白的跨膜区（富含正电荷氨基酸）,并且它的细胞内C端有一个Per-Arnt-Sim（PAS）区,即氧感受器,对缺氧感受起重要作用。肿瘤组织中抑癌基因VHL（von Hippel-Lindau）表达降低可激活Eag1通道,增强HIF-1α的稳定性,上述研究结果提示Eag1通道可能在肿瘤细胞缺氧感受及HIF-1α的调控中起重要的作用。但缺氧条件下Eag1通道对宫颈癌细胞HIF-1α表达调控方面的研究未见报道。本课题通过研究缺氧条件下Eag1表达和活性的变化以及该钾离子通道对HIF-1α调控作用,同时观察钾通道阻断剂对Hela细胞中子照射的影响,以期为提高中晚期宫颈癌患者中子放射治疗效果提供理论依据。实验方法1.采用免疫组化方法,检测不同宫颈组织中Eag1和HIF-1α蛋白的表达情况;采用免疫荧光、RT-PCR、Western-blot等方法,检测不同缺氧条件以及使用Eag1钾离子通道阻断剂情况下Hela细胞中Eag1与HIF-1αmRNA和蛋白表达的特点及其相关性。2.采用全细胞膜片钳记录的方法,观察常氧及缺氧条件下宫颈癌Hela细胞膜上Eag1钾离子通道电生理特点,研究缺氧对其通道活性的影响。3.采用激光共聚焦方法,观察缺氧条件下Eag1钾离子通道活性对细胞内[Ca2+]i、线粒体膜通透性转换孔（mPTP）、线粒体膜电位（Δψ）的影响;采用电镜观察缺氧条件下线粒体超微结构的变化;采用流式细胞仪及高效液相色谱分析法检测缺氧条件下Eag1钾离子通道开放状态对活性氧（ROS）、ATP、ADP、AMP以及能荷生成的影响。4.采用MTT、流式细胞仪、RT-PCR和Western-blot等方法,检测不同浓度钾离子阻断剂4-氨基吡啶（4-AP）对宫颈癌Hela细胞中子照射后细胞增殖抑制率、凋亡率以及HIF-1αmRNA和蛋白表达的影响。实验结果1.免疫组化结果表明,宫颈上皮内瘤变组织内Eag1与HIF-1α蛋白的表达均明显高于正常组,宫颈癌组织内Eag1与HIF-1α蛋白的表达明显高于宫颈上皮内瘤变组;Ⅰ+Ⅱ期宫颈癌组织中Eag1与HIF-1α表达明显高于0期,Ⅲ+Ⅳ期宫颈癌组织内Eag1与HIF-1α表达明显高于Ⅰ+Ⅱ期,Eag1和HIF-1α的表达均与病理分级无明显相关性,Eag1蛋白表达与HIF-1α表达呈正相关（r=0.520,p<0.01）。免疫荧光、RT-PCR、Western-blot结果表明,正常培养条件下宫颈癌Hela细胞中即有Eag1及HIF-1α蛋白表达;缺氧条件下,随缺氧程度加深及缺氧时间的延长,其表达均明显增强,Eag1钾离子通道阻断剂能明显减弱HIF-1α的表达和转位。2.全细胞膜片钳记录结果表明,Hela细胞中Eag1钾离子通道是电压依赖性的,具有延迟整流及不失活特性;轻度缺氧条件能使Hela细胞膜电位增大,Eag1钾离子通道电流强度增大、激活时间缩短。3.轻度缺氧条件下Eag1钾离子对宫颈癌Hela细胞内环境的影响有以下几个方面:（1）细胞内Ca2+浓度升高;（2）线粒体膜通透性转换孔开放;（3）线粒体膜电位降低;（4）线粒体出现数量增多,体积增大、嵴增多等改变;（4）ROS生成增多;（5）线粒体呼吸功能增强;（6）细胞储备能力增强。而钾离子通道阻断剂能减弱上述变化。4.给予不同浓度钾离子通道阻断剂4-AP后,在相同缺氧条件和中子照射剂量下,Hela细胞的增殖抑制率、凋亡率与钾离子通道阻断剂4-AP浓度呈正相关,HIF-1αmRNA和蛋白表达与钾离子通道阻断剂4-AP浓度呈负相关。主要结论1. Eag1和HIF-1α蛋白表达均与宫颈癌病变发展程度相关,其表达均随宫颈癌临床分期升高而增加,与病理分级无明显相关性,Eag1与HIF-1α表达呈正相关;正常培养的宫颈癌Hela细胞内有Eag1mRNA表达,其表达量受缺氧程度和时间的影响;缺氧条件下Eag1钾通道对HIF-1α的表达起一定的调控作用。2.缺氧条件下Hela细胞膜上Eag1钾离子通道有电生理活动的改变,提示Eag1在细胞缺氧感受中起重要的作用。3. Eag1钾离子通道活性改变对线粒体结构和功能有重要的影响,缺氧条件下Eag1可能通过改变线粒体结构和功能调控HIF-1α的表达。4.钾通道阻断剂4-AP能明显降低相同缺氧条件、相同中子照射剂量下Hela细胞内HIF-1αmRNA和蛋白表达水平,增加细胞的增殖抑制率和凋亡率,增强放疗效果,这将为中晚期宫颈鳞癌的放射治疗提供新的研究方向。
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- [1].钾离子通道在黄曲霉菌孢子萌发中的作用[J]. 食品与生物技术学报 2020(02)
- [2].探究钾离子通道与肿瘤的关系[J]. 现代养生 2019(06)
- [3].房颤中心房钾离子通道重构机制及相关药物的研究进展[J]. 中华临床医师杂志(电子版) 2014(01)
- [4].钾离子通道与疼痛的发生和发展[J]. 中华临床医师杂志(电子版) 2012(23)
- [5].中电导钙激活钾离子通道在肿瘤中的作用[J]. 西南军医 2012(02)
- [6].钾离子通道与细胞生物学特性[J]. 基层医学论坛 2009(28)
- [7].钾离子通道四聚化需要定位于内质网的伴侣分子辅助[J]. 科学新闻 2018(04)
- [8].揭秘和癌症相关的钾离子通道的结构特性[J]. 肿瘤防治研究 2016(09)
- [9].12种真菌钾离子通道蛋白生物信息学分析[J]. 食品工业科技 2018(16)
- [10].电压门控钾离子通道与癫痫[J]. 中风与神经疾病杂志 2010(06)
- [11].ATP敏感性钾离子通道与低氧性肺动脉高压关系的研究进展[J]. 温州医科大学学报 2017(11)
- [12].磷脂酰肌醇4,5-二磷酸对电压依赖的钾离子通道开放的调节研究进展[J]. 贵州医药 2015(09)
- [13].果蝇的内向整流型钾离子通道(英文)[J]. 生理学报 2012(05)
- [14].电针内关对心肌缺血大鼠电压门控钾离子通道蛋白的影响[J]. 时珍国医国药 2015(04)
- [15].乙酰胆碱激活的钾离子通道在心肌中的分布特点及其电生理作用[J]. 中国心脏起搏与心电生理杂志 2011(05)
- [16].国外期刊亮点[J]. 科技导报 2015(05)
- [17].检测心肌细胞钾离子通道蛋白活化水平方法的优化[J]. 生物工程学报 2008(03)
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- [19].植物钾离子通道AKT1的研究进展[J]. 生物技术通报 2019(04)
- [20].胰岛细胞ATP敏感的钾离子通道的结构[J]. 科学新闻 2018(04)
- [21].ATP敏感性钾离子通道在脑缺血缺氧中的双重作用[J]. 医学综述 2016(06)
- [22].小麦钾离子通道蛋白基因TaAKT1的功能分析[J]. 麦类作物学报 2018(12)
- [23].神经系统ATP敏感性钾离子通道相关研究进展[J]. 华中科技大学学报(医学版) 2015(01)
- [24].植物钾(K~+)离子通道的研究[J]. 山西农业科学 2008(02)
- [25].多功能钾离子通道BKCa的研究进展[J]. 医学综述 2018(04)
- [26].钾离子通道基因多态性与心房颤动易感性研究进展[J]. 现代医药卫生 2014(05)
- [27].心血管系统ATP敏感性钾离子通道的结构和功能[J]. 华中科技大学学报(医学版) 2014(04)
- [28].不同化学结构药物与hERG钾离子通道的相互作用[J]. 中国药科大学学报 2011(05)
- [29].TWIK相关酸敏感钾离子通道在呼吸与睡眠调节中的研究进展[J]. 中国医学科学院学报 2018(05)
- [30].中电导钙激动钾离子通道在原发性肝癌中的表达及其意义[J]. 中国普通外科杂志 2014(01)