论文摘要
目的:利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌中原核表达多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2全长编码序列,纯化复性后对其活性进行检测。方法:用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3,转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代半乳糖（IPTG）诱导获得相应表达产物——谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白,用Western印迹验证。表达产物复性后用谷胱甘肽-琼脂糖（Glutathione-Sepharose）4B亲和层析柱进行纯化。建立酶促反应体系,利用高效液相色谱（HPLC）进行酶活检测。结果:成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3/T2,通过蛋白质电泳检测到分子量约为90KD的融合蛋白的表达,并经Western印迹得以验证。利用亲和层析得到纯化的酶蛋白,经反向HPLC检测证明其具有一定活性。结论:本研究中ppGalNAc-T2全长编码序列被成功表达和纯化,且具有一定催化活性,为进一步制备其多克隆抗体和蛋白质结晶打下了坚实基础。
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