玉米CMS-S核恢复基因及玉米对淹水胁迫响应基因的功能分析

论文题目: 玉米CMS-S核恢复基因及玉米对淹水胁迫响应基因的功能分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 张祖新

导师: 郑用琏

关键词: 玉米,细胞质雄性不育,育性恢复基因,转录谱,程序性细胞死亡,厌氧胁迫,锌指蛋白

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 杂种优势的利用是提高作物单位面积产量的有效途径。玉米（Zea mays L.）是世界上最早利用杂种优势的作物之一。利用不育系进行杂交制种可以免去人工去雄,降低了劳动成本、提高种子纯度,在杂种优势的利用中具有明显的优越性。为了更好地发挥玉米不育系在杂种优势利用中的作用,在理论上阐明细胞质雄性不育（CMS）和育性恢复机理具有重要的理论意义,同时在核质互作分子机理的研究领域中,CMS己成为重要的模式性状。玉米CMS-S系的育性由线粒体上嵌合基因orf355/orf77和核基因（Rf3/rf3）共同决定。虽然orf355/orf77已被克隆,并对其影响细胞质和核基因的表达进行许多研究,但核育性基因Rf3/rf3的克隆,表达产物的鉴定、与线粒体基因和其他核基因互作关系的阐明等仍有待继续深入的研究。本研究以Rf3/rf3近等基因系S-MO17Rf3Rf3/S-MO17rf3rf3为材料,利用cDNA microarray和抑制性扣除杂交（SSH）技术,在转录水平上对玉米CMS-S核恢复基因进行功能基因组学研究,得到以下初步结果: 1、在玉米S-Mo17Rf3Rf3生长的不同时期,分别提取不同组织的mRNA,构建了玉米幼芽（含胚芽鞘）、三叶期幼苗（含根系）、淹水处理后的三叶期幼苗（含根系）、六叶期整株（含根系）、拔节期茎间居间生长组织、花药、授粉5天后的雌穗和开花期成熟叶共8个cDNA文库;等量混合各文库的质粒DNA,采用基因组DNA饱和杂交法进行均一化处理,构建了一个含6×104个克隆的均一化cDNA文库（MONL）。该文库的插入片段在0.4kb～4.0kb之间,平均长度为1.18kb;71%的序列为unique ESTs,12%以上的插入片段为现有核酸数据库中所没有同源序列的新序列,76%的插入序列为未知功能序列。cDNA克隆代表了多个组织和发育时期的RNA,且代表高丰度表达基因的cDNA克隆所占比例低,平均每个持家基因在文库中的频率约为0.4%,能在均一化文库中检测到低丰度表达基因的cDNA克隆。 2、将MONL文库中的cDNA插入片段进行PCR扩增,通过Agarose胶电泳检测,将扩增质量较好的10830个克隆的PCR产物,点制在尼龙膜上,制作cDNA microarray。使用5个组织的mRNA混合样与cDNA microarray进行重复杂交实验,检测芯片质量,结果表明,重复实验的芯片间各对应点的信号强度和芯片内两重复点的信号强度的重复性较好,R2分别为0.9728和0.965。 3、采用不连续蔗糖密度梯度离心,将不同发育状态的小孢子和花粉分为没有形成液泡的小孢子（Y）,已形成多个小液泡的小孢子（SV）、形成了大液泡的小孢子（LV）和淀粉充实或败育程度不同的花粉（SF1～SF3/CP1～CP3）。分别将3种发育状态（SV、LV、SF1/CP1）的S-（Rf3）和S-（rf3）花粉mRNA反转录后与cDNA microarray杂交,结果显示,（1）SV、LV和SF与cDNA microarray杂交的阳性克

论文目录:

中文摘要

Abstract

Abbreviation

1 前言

1．1 玉米细胞质雄性不育研究进展

1．1．1 玉米细胞质雄性不育系的胞质分类

1．1．2 玉米 CMS核基因的遗传

1．1．3 玉米 CMS-S雄花育性的不稳定遗传

1．1．4 育性相关mtDNA读码框(ORF)的克隆与表达

1．1．5 不同育性材料间基因表达的差异

1．1．6 育性相关核基因的克隆及雄性不育性恢复机理的假说

1．1．7 近期对玉米 CMS分子生物学研究的主要方向

1．2 玉米对淹水胁迫早期响应基因的研究进展

1．2．1 淹水胁迫对玉米的伤害及其原因

1．2．2 玉米根系的厌氧代谢

1．2．3 基因表达与厌氧蛋白合成及其调节基因表达

1．2．4 厌氧信号氧敏感因子

1．2．5 玉米对淹水胁迫的适应

1．3 本研究的目的与意义

1．3．1 玉米 CMS-S核恢复基因(Rf3)克隆与功能研究

1．3．2 玉米对低氧胁迫早期响应基因的克隆与功能研究

2 材料与方法

2．1 植物材料

2．2 材料的处理方法

2．2．1 玉米材料的淹水处理

2．2．2 玉米不同发育时期的小孢子和花粉的分离

2．3 总 RNA抽提与mRNA的纯化

2．4 cDNA文库的构建

2．5 玉米基因组DNA亲和杂交体系的建立及cDNA文库的均一化

2．6 DNA Microarray的制作、杂交及数据处理

2．7 Northern杂交分析

2．7．1 电泳与转膜

2．7．2 探针标记

2．7．3 杂交

2．7．4 膜的重复利用

2．8 持家基因cDNA片段的扩增与克隆

2．9 全长cDNA的扩增与克隆

2．10 SSH分析

2．10．1 SSH分析与扣除文库的构建

2．10．2 差异表达基因cDNA片段的筛选

2．11 玉米和水稻的比较基因组分析

3 结果与分析

3．1 覆盖多个组织和发育时期的均一化cDNA文库的构建

3．1．1 总 RNA的提取与 poly(A~+)RNA的纯化

3．1．2 玉米持家基因的克隆

3．1．3 独立cDNA文库的构建

3．1．4 cDNA均一化文库的构建及均一化效果分析

3．1．5 cDNA文库质量评价

3．2 不同发育时期的花粉中基因表达差异分析

3．2．1 不同发育时期的小孢子和花粉的分离

3．2．2 芯片的点制与质量检测

3．2．3 不同发育时期花粉中基因表达分析

3．3 不同基因型的花粉中基因表达差异分析

3．3．1 不同基因型间基因表达模式的差异

3．3．2 不同基因型间2倍以上差异表达的克隆数

3．3．3 差异表达基因的功能分析

3．3．4 凋亡相关基因在不同基因型花粉中的表达

3．3．5 细胞凋亡和信号转导相关基因表达的时空特异性

3．3．6 几个玉米基因的全长cDNA克隆

3．4 不育与育性恢复花粉中基因表达差异的SSH分析

3．4．1 正向和反向扣除文库的建立与评价

3．4．2 正向和反向扣除文库中克隆的差异筛选

3．4．3 差异表达基因的功能分析

3．5 几个重要的候选基因在玉米染色体上的定位研究

3．6 不育系花药组织和花粉细胞的DNA寡聚核糖体片段

3．7 玉米根系对淹水胁迫的早期响应研究

3．7．1 淹水 2h后玉米根系中的基因表达

3．7．2 1个在低氧条件下诱导表达的类锌指蛋白基因的表达

4 讨论

4．1 MONL文库质量说明饱和基因组杂交法均一化cDNA文库是有效的

4．2 饱和基因组杂交法与其它均一化方法的比较

4．3 S-(Rf3)和S-(rf3)花粉发育过程中的生理生化差异

4．4 可育与败育花粉发育过程中的信号传导的差异及其调控

4．4．1 Ca~2+信号传导

4．4．2 G蛋白信号传导

4．4．3 依赖多糖的信号传导

4．5 细胞凋亡与玉米 S-型细胞质雄性不育

4．6 核基因对细胞质基因表达的调控

4．7 玉米类锌指蛋白可能在蛋白质生物合成中起作用

4．8 翻译水平的调节在玉米淹水早期对低氧胁迫响应中起着重要的作用

参考文献

致谢

附录1: Genomic DNA isolation (CTAB)

附录2: Total RNA Extraction

附录3: Small-scale mRNA Isolation(For PolyATtract~(?) Systems IV ,promega,USA)

附录4: Plasmid Mini-Preps

附录5: Nucleo Trap Gel Extraction Protocol

附录6: DNA isolation for DNA Ladder

附录7: 在校期间已发表和待发表的学术论文

发布时间: 2005-12-05

参考文献

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