论文摘要
目的:在新生大鼠大脑皮层神经元分离、纯化、培养和鉴定的基础上,建立体外大脑皮层神经元缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤模型,阐明体外I/R损伤中神经元凋亡发生机制,探讨白藜芦醇苷（polydatin, PD）对体外I/R神经元损伤的作用。方法:在无菌条件下,将出生24h内的新生Sprague Dawley大鼠断头取脑,剔除脑膜及血管,分离皮层神经元,原代培养7d,进行纯度测定后,再随机分为3组:对照组、I/R损伤组和PD治疗组。对照组用DMEM/F12培养基处理15min后,用无血清培养基继续培养;I/R损伤组用连二亚硫酸钠（Na2S2O4）溶液处理15min后,用无血清培养基继续培养;PD治疗组在Na2S2O4溶液处理前、中、后均加入PD进行干预;在继续培养0h、6h、12h、24h、48h五个不同时间点获取标本待检。用AO/EB及DAPI染色,在荧光显微镜下观察神经元的形态学变化,用TUNEL检测神经元凋亡率,免疫组化检测神经元Bcl-2、Bax及NF-κBp65的表达。结果:（1）在倒置相差显微镜下观察,原代培养7d的大鼠大脑皮层神经元胞体饱满,立体感强,突起较长,相互连接,形成致密的网络。（2）AO/EB及DAPI染色可见I/R损伤组有凋亡细胞的特征性形态变化。（3）I/R损伤组神经元凋亡率在0h时无变化,6h增高,24h达峰值,48h降低;并在6h、12h、24h及48h对应时间点均高于对照组,有统计学差异（P<0.05）。PD治疗组神经元凋亡率在6h、12h、24h及48h对应时间点均低于I/R损伤组,有统计学差异（P<0.05）。（4）I/R损伤组NF-κBp65的表达量随再灌注时间的延长而增加,24h达高峰, 24h～48h从胞浆向胞核移位明显,NF-κBp65与Bcl-2/Bax间存在较强的负相关性（P<0.05）。PD治疗组NF-κBp65表达量降低,在6h、12h、24h及48h对应时间点低于I/R损伤组,有统计学差异（P<0.05）。I/R损伤组Bax的表达量随再灌注时间的延长而明显增加,24h达高峰,之后降低;Bcl-2的表达量及Bcl-2/Bax比率均在6h达高峰,随后渐降低;且Bcl-2/Bax比率与凋亡间存在较强的负相关性（P<0.05）。PD治疗组Bcl-2增高而Bax降低,与I/R损伤组在6h、12h、24h及48h对应时间点的值相比有统计学差异（P<0.05）。结论:（1）在分离、纯化、培养和鉴定新生大鼠大脑皮层神经元的基础上,成功的建立了体外大脑皮层神经元I/R损伤模型。（2）PD通过降低I/R损伤神经元凋亡的发生率而起保护作用,其减少神经元凋亡作用的可能机制是抑制NF-κBp65激活,上调Bcl-2/Bax比率。
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