产氨短杆菌发酵及固定化产氨短杆菌合成辅酶A工艺研究

2020-12-02阅读(998)

论文摘要

辅酶A（coenzyme A,CoA）广泛地存在于动物、植物、微生物组织和细胞中,是乙酰化酶的辅酶,参与生物体内的乙酰化反应,起着传递乙酰基的作用,对糖、蛋白质和脂类的代谢起重要作用。目前,生产CoA的方法主要为微生物发酵法,所用菌种为产氨短杆菌。影响CoA发酵水平的主要因素是菌种、培养基和培养条件。本课题针对国内CoA发酵水平还较低的现状,对菌种和培养基两方面进行了重点研究,提高了CoA的发酵水平。同时,对产氨短杆菌发酵菌体进行了固定化,对固定化产氨短杆菌生产CoA进行了初步研究,取得了预期的效果。1产氨短杆菌发酵CoA工艺研究（1）通过对原始菌种单细胞分离纯化,分离得到了一株产量较高的产氨短杆菌,用基础培养基发酵,CoA产量可达273 U/mL,比原始菌种的CoA产量（181U/mL）提高了50%。（2）通过种子生长曲线的测定,确定种子转种时种子质量控制指标,以种子液pH 6.4～6.6,菌种密度A在0.6～0.8之间为佳,最适种龄一般在18～20 h。（3）通过种子接种量实验,确定了较合适的接种量,接种量以10%～12.5%（v/v）CoA产量最高。（4）通过培养基灭菌方式实验,以采用葡萄糖+蛋白胨+酵母粉+硫酸镁,121℃灭菌15 min;磷酸盐+尿素100℃灭菌5 min;分别冷却至30～32℃后合并的灭菌方式为佳。灭菌后培养液色泽较浅,发酵周期短,CoA产量高。（5）通过有机氮源组合实验,确定了最佳组合为蛋白胨与玉米浆粉。以蛋白胨与玉米浆为有机氮源,发酵周期短,CoA产量高。（6）通过系列培养基成分浓度实验,确定了较合适的培养基配比。培养基配比为葡萄糖10%,蛋白胨1.2%,玉米浆粉0.8%,硫酸镁1%,KH2PO41%,K2HPO4 1%,尿素0.7%。用此培养基配比摇瓶发酵,CoA产量达360 U/mL,比使用基础配方的CoA产量（273 U/mL）提高30%以上。（7）前体分两次加入优于一次性加入。第一次加入前体总量的3/4,6 h后第二次加入前体总量的1/4,CoA产量达420 U/mL,比一次性加入前体的CoA产量（372 U/mL）提高约12%。（8）10 L发酵罐放大实验结果较理想,CoA产量达到527 U/mL,比摇瓶实验工艺CoA产量（420 U/mL）提高了约25%。2固定化产氨短杆菌的制备及其合成CoA的初步研究（1）通过对不同载体制备的固定化细胞的凝胶性能及CoA合成能力的综合考察,筛选出的制备固定化产氨短杆菌细胞合适载体为卡拉胶-魔芋胶-刺槐豆胶。（2）通过凝胶配方的优化实验,确定复合凝胶的最佳配方为:卡拉胶1.0%,魔芋胶0.4%,刺槐豆胶0.4%。（3）通过培养液配方的优化实验,确定合成CoA的前体培养液浓度为:ATP2%,泛酸钙0.3%,半胱氨酸0.3%。（4）固定化产氨短杆菌在中性或偏酸性培养液中合成CoA的能力较强,在偏碱性环境中合成CoA的量很少。（5）在前体培养液中添加适量的苯扎溴铵有利于CoA的合成,苯扎溴铵的最适浓度为0.05%。（6）固定化产氨短杆菌细胞经过凝胶配方优化和培养液配方优化后,CoA最高产量可达360 U/mL,在重复使用8次后,CoA合成能力仍保存50%以上。3本课题研究的成果（1）通过对产氨短杆菌菌种的分离纯化、种子培养质量指标控制、发酵培养基和前体物质加入方式的研究,摇瓶发酵CoA的产量达到420 U/mL,比原始菌种和基础培养基摇瓶发酵CoA的产量181 U/mL提高了130%。（2）10 L发酵罐放大实验结果较理想,CoA产量达到527 U/mL,比摇瓶实验工艺CoA产量（420 U/mL）提高了约25%,比国内发酵生产工艺CoA产量（平均250 U/mL）提高了110%。（3）制备了以卡拉胶-魔芋胶-刺槐豆胶为合适载体的固定化产氨短杆菌细胞,确定了固定化产氨短杆菌细胞合成CoA的合适条件。在优化的条件下,固定化产氨短杆菌细胞的产量可达360 U/mL,为进一步研究建立了良好的基础。

论文目录

摘要

ABSTRACT

符号说明

第一章前言

1 CoA的理化性质、生物合成、生化功能和应用

1.1 CoA简介

1.2 CoA的化学组成和理化性质

1.2.1 CoA的化学组成

1.2.2 CoA的理化性质

1.3 CoA的生物合成和体内代谢

1.4 CoA的生化功能

1.5 CoA缺乏引起的症状

1.6 CoA的临床应用

1.7 营养保健作用

2 CoA的含量（效价）测定方法

2.1 磺胺乙酰化酶（鸽肝酶）法

2.2 磷酸乙酰化酶法（PTA酶法）

2.3 高效液相色谱法

3 CoA的生产方法

3.1 动物脏器猪肝提取法

3.2 酵母提取法

3.3 微生物发酵法

3.3.1 干细胞法

3.3.2 直接培养法

3.3.3 提高CoA发酵水平的途径

4 固定化细胞技术及固定化产氨短杆菌合成CoA

4.1 固定化细胞技术概述

4.1.1 固定化细胞技术定义

4.1.2 固定化微生物细胞的优点

4.1.3 固定化细胞的制备方法

4.1.4 固定化细胞常用载体

4.1.5 固定化细胞技术面临的问题及展望

4.2 固定化产氨短杆菌合成CoA

5 CoA的分离纯化

6 本课题的研究目的及拟解决的问题

6.1 研究目的

6.2 研究内容

第二章产氨短杆菌发酵CoA工艺研究

1 仪器、设备和材料

1.1 仪器和设备

1.2 材料

1.2.1 菌种

1.2.2 试剂

2 方法

2.1 基础培养基

2.2 菌种对CoA发酵的影响

2.2.1 原始菌种CoA生产能力考察

2.2.2 菌种自然分离纯化

2.2.3 菌种生长曲线及培养质量指标的控制

2.2.4 接种量对发酵周期、菌量和CoA产量的影响

2.3 培养基对CoA发酵的影响

2.3.1 培养基灭菌方式对培养液色泽、发酵周期和CoA产量的影响

2.3.2 不同有机氮源及组合对发酵周期、菌量和CoA产量的影响

2.3.3 蛋白胨浓度对CoA产量的影响

2.3.4 玉米浆粉浓度对CoA产量的影响

2.3.5 尿素浓度对CoA产量的影响

2.3.6 葡萄糖浓度对CoA产量的影响

2+浓度对CoA产量的影响'>2.3.7 磷酸盐、Mg²⁺浓度对CoA产量的影响

2.4 前体物质加入方式对CoA产量的影响

2.5 10L发酵罐放大实验

2.5.1 10L发酵罐实验

2.5.2 10L罐CoA发酵代谢曲线测定

3 分析方法

3.1 发酵液CoA效价的测定

3.1.1 乙酰化酶（鸽肝酶）的制备

3.1.2 CoA效价测定

3.1.2.1 所需溶液的配制

3.1.2.2 测定CoA效价步骤

3.2 发酵液葡萄糖含量测定

3.3 培养液菌种量（菌种密度）的测定

4.结果与讨论

4.1 菌种对CoA发酵的影响

4.1.1 菌种自然分离纯化

4.1.2 菌种生长曲线及培养质量指标的控制

4.1.3 接种量对发酵周期、菌量和CoA产量的影响

4.2 培养基对CoA发酵的影响

4.2.1 培养基灭菌方式对培养液色泽、发酵周期和CoA产量的影响

4.2.2 不同有机氮源及组合对发酵周期、菌量和CoA产量的影响

4.2.3 蛋白胨浓度对CoA产量的影响

4.2.4 玉米浆粉浓度对CoA产量的影响

4.2.5 尿素浓度对CoA产量的影响

4.2.6 葡萄糖浓度对CoA产量的影响

2+浓度对CoA产量的影响'>4.2.7 磷酸盐、Mg²⁺浓度对CoA产量的影响

4.3 前体物质加入方式对CoA产量的影响

4.4 10L发酵罐放大实验

4.4.1 10L发酵罐实验结果

4.4.2 CoA发酵代谢曲线

5 小结

第三章固定化产氨短杆菌的制备及其合成CoA的初步研究

1 仪器与材料

1.1 仪器

1.2 材料

1.2.1 菌种

1.2.2 试剂

2 方法

2.1 菌体细胞的培养与收集

2.1.1 培养基配方

2.1.2 菌体的培养

2.1.3 菌体的收集

2.2 不同载体固定化细胞的制备

2.2.1 用海藻酸钠固定化

2.2.2 用聚丙烯酰胺固定化

2.2.3 用聚乙烯醇固定化

2.2.4 用卡拉胶固定化

2.2.5 CoA的合成条件

2.2.6 不同载体对CoA合成的影响

2.2.7 不同表面活性剂对CoA合成的影响

2.2.8 不同载体制备的固定化细胞的稳定性

2.3 固定化细胞合成CoA的条件优化

2.3.1 凝胶配方的优化

2.3.2 前体培养液配方的优化

2.3.3 前体培养液pH值对CoA合成的影响

2.3.4 表面活性剂的浓度对CoA合成的影响

2.3.5 固定化细胞的稳定性考察

2.4 分析方法

2.4.1 凝点的测定

2.4.2 凝胶强度的测定

2.4.3 菌体细胞泄漏的比较

2.4.4 CoA效价的测定

3 结果与讨论

3.1 载体的选择

3.1.1 用海藻酸钠固定化

3.1.2 用聚丙烯酰胺固定化

3.1.3 用聚乙烯醇固定化

3.1.4 用卡拉胶固定化

3.1.5 不同载体制备的凝胶的性能比较

3.1.6 CoA合成能力的比较

3.1.7 不同表面活性剂对CoA合成的影响

3.1.8 不同方法制备的固定化细胞的稳定性比较

3.2 固定化细胞合成CoA的条件优化

3.2.1 凝胶配方的优化

3.2.2 优化前体培养液配方的正交试验分析

3.2.3 前体培养液不同pH对CoA合成的影响

3.2.4 添加不同表面活性剂对CoA合成的影响

3.2.5 固定化细胞的稳定性

参考文献

致谢

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