M1GS功能结构位点的初步研究

论文摘要

大肠杆菌来源的RNase P是特异性剪切前体tRNA（ptRNA）的5′端,使之成熟的天然核酶,该酶的催化核心为一个377nt的RNA亚单位（M1RNA）,具有独立剪切RNA的核酶活性。RNase P是结构识别酶,RNase P的模式底物至少包括两个要件:1 游离NCCA-3′术端;2 特异互补的双链RNA区域。人为设计的引导序列GS（guide sequence）与mRNA形成RNase P能够识别的底物形式。人工核酶M1GS就是由大肠杆菌来源的RNase P的催化中心M1RNA与引导序列GS共价连接而成的新型核酶,在引导序列GS引导下可实现对模式底物的特异切割。 本课题以人巨细胞病毒（HCMV）DNA聚合酶基因UL54为靶基因,针对该基因构建了人工核酶M1GS-T7,并从M1GS-T7的二级结构和体外切割活性两方面进行研究,从而探索M1GS-T7结构和活性的对应关系,为进一步研究M1GS的功能和结构奠定理论基础。 构建了两种不同基因组成的人工核酶M1GS-T7,M1GS-T7bridge,以研究连接序列（bridge）对M1GS活性的影响,两种转录模板DNA分别包括有T7启动子、M1RNA基因、bridge序列以及GS序列四个组成部分的M1GS-T7bridge和不包括连接序列的M1GS-T7。RNA二级结构模拟显示:在无连接序列的M1GS-T7中,GS参与了M1RNA二级结构的形成,从而破坏了M1RNA的活性构象;而加入了连接序列的M1GS-T7bridge,维持了M1RNA的独立折叠。体外切割结果显示:有连接序列的M1GS-T7bridge仍然有体外切割活性,无连接序列的M1GS-T7失去体外切割活性。 模拟了M1GS-T7bridge在不同温度下的二级结构,模拟结果显示:温度降低到20℃时,M1RNA的各个螺旋区域进行重排;而当温度升高到55℃时,M1RNA的结构中,对M1RNA维持活性必需的,且与底物CCA末端直接作用的重要螺旋发生了变化。体外切割实验结果显示,20℃ M1GS-T7bridge无活性了,而55℃相比37℃下的活性高了。说明在M1RNA中,催化活性部位相对非活性部位有更强的敏感性,活性部位的结构变化对应着核酶活性的高低变化,非活性部位的变化对应着核酶活性的有无。 为一步证实55℃下,M1GS-T7bridge活性的提高是由于二级结构的改变,根据RNA二级结构模拟,引入了突变G250G251G260G275到T250T251A260C275,使突变后的mM1GS-T7bridge的37℃下的二级结构与野生型M1GS-T7bridge的55℃的结构一致;体外切割检测两者的活性,结果显示,突变型核酶比野生型核酶活性略高,证明核酶的二级结构与其活性之间有严

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 RNaseP简介
• 1.2 HCMV和UL54基因
• 1.3 MIGS研究方法简介
• 1.4 课题意义
• 2 实验仪器与材料
• 2.1 实验仪器
• 2.2 实验材料
• 3 技术路线
• 3.1 桥序列在构建MIGS中的作用
• 3.2 温度变化下对MIGS-T7bridge结构预测和活性鉴定
• 3.3 核酶突变体mMIGS-T7bridge的结构预测和活性鉴定
• 4 实验方法
• 4.1 桥序列在构建MIGS中的作用
• 4.2 温度变化下对MIGS-T7bridge结构预测和活性鉴定
• 4.3 突变体mMIGS-T7bridge结构预测和活性鉴定
• 5 结果与分析
• 5.1 桥序列在构建MIGS中的重要作用
• 5.2 温度变化下对MIGS-T7bridge结构预测和活性鉴定
• 5.3 突变体mMIGS-T7bridge的结构预测与活性鉴定
• 6 讨论
• 6.1 桥序列的连接作用
• 6.2 关于计算机模拟RNA二级结构的可信性
• 6.3 活性部位的柔性与酶催化活性之间的关系
• 6.4 关于核酶体外切割效率低的和核酶非特异性切割的讨论
• 7 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 前景与展望
• 8 附录
• 8.1 各种核酶的活力参数比较
• 8.2 GENEBANK公布MIRNA基因全序列
• 8.3 MIRNA基因测序结果（序列）
• 9 参考文献
• 致谢