猪肠道病毒的分离鉴定及其全基因组序列测定与分析

论文摘要

【目的】猪肠道病毒感染（Porcine enterovirus infection）是由猪肠道病毒（Porcine enterovirus,PEV）所引起,有多种不同的临床表现,如猪脑脊髓灰质炎、生殖障碍、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎、皮肤损伤及无症状等,是一种危害养猪业的重要传染病。本研究通过接种PK细胞分离鉴定出一株此病毒,参考GenBank已发表猪肠道病毒-9型参考株UKG 410/73（Y14459）的序列设计合成引物,克隆并测定了猪肠道病毒分离株的全基因序列,为进一步对该病的诊断和预防奠定了基础。【方法】本研究将采集的病料,经过PBS悬浮后,在PK细胞中盲传数代,直到出现细胞病变,最后细胞从瓶壁脱落。反复冻融3次后,收集细胞及培养液,电镜观察,发现病毒粒子。根据GenBank已发表的各型猪肠道病毒5’UTR高度保守区的序列设计特异性引物,通过RT-PCR方法扩增得到目的基因,并克隆到pMD-18 T载体上,进行序列测定,用DNAStar软件与NCBI BLAST上相关序列比较分析,根据同源性最高的序列设计特异性引物进行分离株全基因组的序列测定,并与30株参考毒株的核苷酸序列和推导氨基酸序列进行比对。【结果】所采集的病料,在PK细胞中盲传3代便出现细胞病变,表现为细胞内颗粒增多,细胞收缩、变圆,最后细胞从瓶壁脱落。用磷钨酸负染电镜观察,病毒呈圆形、无囊膜,且呈二十面体对称。通过RT-PCR方法得到的5’UTR序列与猪肠道病毒参考株UKG 410/73（Y14459）同源性最高,核苷酸同源性为85.5%,结合免疫电镜检测鉴定该病毒属于猪肠道病毒。根据UKG 410/73（Y14459）基因设计8对引物扩增出了分离株的核苷酸全序列。通过与30株毒株比对分析,该分离株与UKG 410/73（Y14459）同源性最高,核苷酸同源性为85.7%,氨基酸同源性为86.6%,根据核苷酸和氨基酸遗传系统进化树分析表明,该分离株与肠道病毒9型属于同一型病毒,证明我国也存在有猪肠道病毒感染。

论文目录

• 摘要
• SUMMARY
• 缩写词英汉对照表
• 第一篇 文献综述 猪肠道病毒的流行病学、致病机制及分子生物学特征
• 1 猪肠道病毒的概述
• 2 猪肠道病毒的分类、血清学及理化特性
• 2.1 猪肠道病毒的分类
• 2.2 猪肠道病毒的血清分型
• 2.3 猪肠道病毒的理化特性
• 3 猪肠道病的流行病学、临床表现、发病机制及病理变化
• 3.1 猪肠道病的流行病学
• 3.2 发病机制
• 3.3 临床症状
• 3.4 病理变化
• 4 猪肠道病毒的诊断
• 4.1 病毒的分离
• 4.2 血清学诊断方法
• 4.3 分子生物学诊断技术
• 5 猪肠道病毒病毒粒子的结构特征
• 6 猪肠道病毒的基因组结构特征
• 7 病毒基因组的复制，蛋白的合成和病毒粒子装配
• 8 肠道病毒的结构蛋白和非结构蛋白及其功能
• 8.1 猪肠道病毒结构蛋白
• 8.2 猪肠道毒非结构蛋白
• 9 猪肠道病毒的抗原性
• 10 疫苗的研究及防制
• 第二篇 研究报告 猪肠道病毒的分离鉴定及其全基因组序列测定与分析
• 1 猪肠道病毒的分离与鉴定
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 细胞
• 1.1.2 病料
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 PK 细胞的制备、培养
• 1.2.2 PK 细胞的换液
• 1.2.3 病毒的分离
• 1.2.4 猪肠道病毒的分离
• 1.2.5 猪肠道病毒的培养
• 1.2.6 磷钨酸负染电镜观察
• 1.2.7 猪肠道病毒特异引物的设计
• 1.2.8 RT-PCR 反应
• 1.2.9 PCR 扩增产物电泳
• 1.2.10 5’UTR 序列测定
• 1.2.11 5’UTR 序列分析
• 2 猪肠道病毒全基因的序列测定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 引物
• 2.1.3 试剂及配制
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 猪肠道病毒的分离与鉴定
• 3.1.1 病毒的细胞分离
• 3.1.2 磷钨酸负染电镜观察
• 3.1.3 5’端PCR 结果
• 3.1.4 5’UTR 核苷酸序列分析
• 3.2 猪肠道病毒全基因组序列分析
• 3.2.1 PCR 扩增结果
• 3.2.2 序列测定的结果及推导的氨基酸序列
• 3.2.3 序列测定的结果及其推导的氨基酸序列
• 3.2.4 猪肠道病毒毒株同源性比对结果
• 4 讨论
• 4.1 猪肠道病毒的分离与鉴定
• 4.2 猪肠道病毒与其它30 个毒株同源性的比较与分析
• 4.3 猪肠道病毒9 型的基因组特征
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介
• 附录